Безклетъчен синтез на протеин

През последните години изследванията на генома доведоха до идентифициране на голям брой гени от различни видове. Понастоящем обаче не може да се присвои определена функция на преобладаващата част от тези генни последователности, тъй като кодираните протеини могат да бъдат представени неадекватно или изобщо не с обичайните клетъчни базирани експресионни методи. Съществена предпоставка за ясно определяне и валидиране на функцията е наличието на правилно синтезирани и обработени протеини. Това води до нарастваща нужда от ефективни системи за синтез на протеини, които са в състояние да генерират протеини от най-различни структурни и функционални класове еднакво високо и качествено. В този контекст методът на безклетъчен синтез на протеини в момента се използва все по-често, тъй като позволява значително ускоряване на необходимите работни стъпки от ДНК до протеин. В допълнение, на безклетъчните протеини могат да се дадат нови свойства, които са от решаващо значение за по-нататъшните технологични приложения.

Начало на развитието на технологиите

Съвременни системи за транслация in vitro

Интензивните изследвания в областта на безклетъчния синтез на протеини в хода на развитието на системата доведоха до факта, че бяха определени ограниченията на прокариотните и еукариотните системи за транслация in vitro и бяха оптимизирани основните параметри. Изследователските области, по които в момента се работи усилено, са по-специално по-нататъшното развитие на транслационно активните клетъчни лизати във високопродуктивни системи, генерирането и оптимизирането на специални ДНК и РНК матрици за различните безклетъчни системи и подобряването на контрола на реакцията в новоразработените реакторни системи.

Възможностите за безклетъчен синтез на протеини се разширяват значително от еукариотните системи за транслация in vitro, тъй като пост-транслационните модификации влияят върху физикохимичните свойства на протеините и често са от съществено значение за тяхната функционалност. Решаващите предимства на безклетъчния протеинов синтез, като високопроизводителния синтез на постоянно активни или цитотоксични мембранни протеини, вече могат да се комбинират с биочип базирани, импедиметрични и електрофизиологични функционални анализи.

Едно от основните предимства на безклетъчния протеинов синтез е възможността за дозиране на линейни шаблони на ДНК директно в отворената система и за пренаписване на кодираната генетична информация в протеини без отнемащи време стъпки на клониране. Това се случва в свързани системи за транскрипция/превод. Шаблоните, създадени с помощта на експресионния PCR процес, съдържат всички елементи, необходими за ефективен протеинов синтез както в прокариотни, така и в еукариотни безклетъчни системи и по избор са оборудвани с последователности, кодиращи различни N- или С-крайни афинитетни маркери. Добавянето на N-терминални сигнални последователности, които са необходими за насочване на мембранни протеини и секретирани протеини в протеолипозоми, също може да се осъществи с този метод. Следователно експресионната PCR е важен инструмент за целенасочено проектиране на протеини, тъй като с този метод могат да бъдат въведени мутации и синтезираните протеини да бъдат модифицирани във функционалните си свойства в еволюционен процес и адаптирани към технологичните изисквания.

Включването на модифицирани и изкуствени аминокиселини, които се въвеждат котранслационно в нарастващите протеинови вериги с помощта на предварително ацилирани тРНК по време на синтеза на протеини, се извършва в прокариотни и еукариотни системи за синтез на протеини без клетки. Определените протеинови конюгати, по-специално мембранни и гликопротеинови конюгати с биотинилирани или флуоресцентни групи, се синтезират по този начин без клетки. Ко-транслационните, специфични за мястото маркировки на протеини са лек метод, който значително опростява функционалната характеристика на произведените протеини. Откриваемостта на вградена биотинилирана или флуоресцентна аминокиселина позволява съответно маркираните мембранни протеини да бъдат локализирани в липидните мембранни структури, както и ефективното откриване на взаимодействие на лиганд. Заедно с експресионната PCR, голямо разнообразие от белязани протеини могат да бъдат синтезирани бързо за скринингови приложения. В допълнение, този метод се използва за производство на протеини под формата на молекулни превключватели, които променят своята емисия на флуоресценция в отговор на външен сигнал.

Лице за контакт:
Д-р Стефан Кубик
Институт за биомедицински технологии на Фраунхофер, IBMT
Отдел за клетъчна биотехнология и биочипове
Безклетъчна група за синтез на протеини
Телефон: 0331/58187-306
Имейл: [email protected]

Още информация:

Характеристики на това съобщение за пресата:
Журналисти, представители на бизнеса, учени
Биология, хранене/здраве/грижи, медицина
надрегионален
Изследвания/трансфер на знания, резултати от изследвания
Немски