Синергетично използване на невронни клетки-предшественици и самосглобяващи се пептиди при експериментално нараняване на гръбначния мозък на шийката на матката

Резюме

Въведение

Повече от 50% от наранявания на гръбначния мозък на шийните прешлени. В клиничното са описани два основни патофизиологични механизма: първоначалната контузия на гръбначния мозък и впоследствие продължаващите компресионни костни фрактури, кървене или оток на тъканите, причинени.

Моделът за притискане/компресия на аневризма имитира и двата патофизиологични механизма: щракването на клипа създава щипка и продължителността на изрязването осигурява компресионния компонент, че компресията в клиничните условия, причинена от костни фрактури, кървене или подуване на тъканите, трае значително по-дълго. Използваният клипс за аневризма се сменя с пръстенна пружина, гарантираща точна и възпроизводима сила на подрязване. По-специално в сравнение с модела на хеми-трансекция или контузия, този модел на клип за аневризма имитира най-добрите клинични среди. Докато пациентите с наранявания на гръдния кош страдат от параплегия, повечето пациенти с увреждания на шийката на матката са квадриплегични и напълно зависими. Анатомичната структура на цервикалния мозък обаче се различава значително в сравнение с тази на гръдния или лумбалния отдел на гръбначния стълб и по този начин по-специално на протокола.

Развитието на медуларни кухини и образуването на белези от тъкани са бариери за възстановяване и регенерация. За да се преодолеят тези препятствия, използването на скеле е обещаващ подход. Самосглобяващите се пептиди могат да се инжектират директно в епицентъра на лезията. Там те са обединени в нанофибърни скелета, които свързват кухината и подобряват инхибиторната среда чрез намаляване на възпалението и плашенето на тъканите. Докато твърдите материали причиняват значително увреждане на гръбначния мозък по време на имплантацията, течните пептиди могат да се инжектират безопасно и без сериозни допълнителни увреждания.

Подобряването на инхибиторната среда със самоорганизиращи се пептиди преди трансплантацията на стволови клетки следователно подпомага клетъчната интеграция, диференциация и в крайна сметка функционално възстановяване след нараняване на шийката на гръбначния мозък.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

ЗАБЕЛЕЖКА: Следният експериментален протокол е одобрен от Комитета за грижа за животните към Университетската здравна мрежа (Торонто, Канада) и е създаден в съответствие с насоките в Инструкциите за грижа и използване на опитни животни, изготвени от Канадския съвет за грижа за животните .

1. Модел на контузия/компресия на щипка за аневризма на маточната шийка

2. Инжектиране на SAP и NPC (14 дни след нараняването)

90% живи клетки в клетъчната суспензия. Разредете клетките в растежна среда (50 х 103 живи клетки/ul) и ги използвайте за клетъчна трансплантация.

  • Направете четири 2 μl (8 μl общ обем, с 4 x 10 5 NPC) интрапинални инжекции двустранно на 2 mm рострално и каудално до мястото на нараняване. След отваряне на твърдата мозъчна обвивка, поставете микро стъкления капиляр на Hamilton на 1,5 mm под гръбната повърхност на гръбначния мозък и инжектирайте 2 μl от клетъчната суспензия. Изберете скорост на инжектиране около 0,5 ml/min (min).
  • В края на всяко инжектиране и преди да извадите капиляра от кабела, изчакайте поне 1 минута, за да позволите на тъканта да се разтегне, за да побере новия обем на клетката. (Фигура 2)

    • 3. Имплантирането на субдурални помпи за прилагане на растежен фактор

    1. Пожертвайте животните в края на периода на наблюдение (напр. 4 седмици след SCI) под дълбока анестезия (5% изофлуран за 2-3 минути) и ги промийте транскардално с 50 ml студен (4 ° C) физиологичен разтвор, последван от 150 ml студен 4% Параформалдехид в 0,1 М фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS).
    2. Отстранете гръбначния мозък и го накиснете в 4% параформалдехид в 0,1 М фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) за 24 часа.
    3. Поставете гръбначния мозък в 25% разтвор на захароза за криоконсервация за 48 часа.
    4. Осигурете надлъжни криосекции с дебелина на задължителния абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Представителни резултати

    При извършване на горната процедура SAP скеле преодолява кухината и осигурява подобрение в инхибиторната среда, по-малко белези на тъкани и увеличаване на преживяемостта на NPC, Фиг. 4 показва надлъжен разрез на гръбначен мозък на плъх до мястото на нараняване, получено 6 седмици след SCI и 4 седмици след инжектиране на QL6 SAP и трансплантация на NPC. QL6 пептидите бяха успешно инжектирани в костния мозък, агрегирани в епицентъра и дифузни ростро-каудални в полусянката. Образите с електронен микроскоп допълнително показват в Фигура 5, където подреждането на 1% (w/v) QL6 пептиди върху нановолоконна структура се разрежда в PBS разтвори в рамките на 2 часа.

    Тази матрица осигурява подобрение в инхибиторната среда с повишено оцеляване и диференциация на клетките, по-малко белези на тъкани и в крайна сметка води до по-добра възможност за функционално възстановяване.

    уре 1 "src ="/files/ftp_upload/52.105/52105fig1highres.jpg "/>
    Фигура 1: Модел на аневризма на контузия/компресия на клип (A) Снимка чрез хирургически микроскоп след ламинектомия на C7/T1 и контузия на клип/компресия на гръбначния мозък на плъх (Б) Гарантирайте изображението на клипа с пръстеновидната пружина точно. Затваряща сила.

    синергетично

    Фигура 2: Точки за инжектиране на SAP и стволови клетки Графично представяне на Точки за инжектиране:. 2 инжекции със стереотактично SAP в епицентъра на лезията, последвани от 4 инжекции на NPC в съседните гръбни колони на разстояние 2 mm каудално и рострално от епицентъра.

    самосглобяващи

    3: Субдурален катетър за приложение на растежен фактор Снимка чрез хирургически микроскоп: (А) Имплантирани субдурални катетри за доставяне на растежни фактори. катетърът е прикрепен с няколко шева 6,0 конца, където са прикрепени параспиналните мускули; малко отваряне на дура при С5; Субдурално позициониране на катетъра с отворен край на катетъра близо до лезията при C7/T1. (Б) Катетър, свързан с микропомпа в субдурална вдлъбнатина, прикрепена към страничния фланг.

    невронни

    Фигура 4: Успешно доставяне на SAP и NPC до цервикалния мозък Флуоресцентно оцветяване (DAPI фон, син) за надлъжен разрез на травматизиран гръбначен мозък плъх. Обозначените SAP (QL6-FITC, зелено) са се събрали в епицентъра на лезията. Инжектираните NPC (DsRed положителни, червени) са в дифузна рустална и каудална посока. Скалата показва 5 мм.

    използване

    Фиг. 5: Образуване на рамка от нанофибър Изображението със сканиращ електронен микроскоп (SEM) показва нановолоконни скелета на монтирани SAP. Мащабната лента се отнася до 1 um).

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Дискусия

    Този протокол е създаден, за да даде възможност на читателя да извърши модел на нараняване на врата на плъхове и да използва комбиниран подход за лечение със SAP и NPC, насърчаващ по-добро възстановяване след SCI на шията.

    Особено в сравнение с други модели на нараняване на шийните прешлени, като модела на (хеми) -трансекция или моделите за отслабване и сътресение, моделът за контузия/компресия на клипа представлява двата основни травматични патофизиологични механизма - натъртване и натиск - и следователно имитира най-добрите клинични Условия. Въпреки че наскоро е създаден за употреба при плъхове и мишката BWS 7-11, той е подходящ за използване в шийните прешлени. Това беше важна стъпка, тъй като нараняванията на гръбначния мозък на шийката на матката са най-често срещаните в клиниката, а анатомията на шийката на матката се различава значително от тази на гръдния кош. В допълнение, пациентите с SCI на врата с тетрапареза се стремят поне частично да възстановят двигателното помазване на горните крайници.

    Самосглобяващите се пептиди са идентифицирани с потенциали за преодоляване на кухината, а също и за подобряване на инхибиторната среда на мястото на лезията, което в крайна сметка дори води до регенерация на аксони и поникване 5, 12,13,14. QN-6 нановолокна се сглобяват, за да създадат скелета, свързващи медуларната кухина и по този начин могат да осигурят матрица за аксоново поникване и регенерация и подобряване на инхибиторната среда преди клетъчната трансплантация. Предимствата на тези пептиди се крият в ниския им вискозитет (течност) и неутралното рН. Особено в сравнение с високо вискозни хидрогелове или тъканни скелета, SAP могат лесно да се инжектират в увредения гръбначен мозък и допълнителните наранявания, получени от самата инжекция, са ограничени.

    Въпреки че самите нанофибри QL6 могат да подобрят клетъчната преживяемост 4,15, но използването на растежни фактори изглежда е от полза за 16,17,18,19,20,21. Те могат да се прилагат или чрез растежни фактори без хидрогелове 22, или чрез приложение чрез осмотични помпи (както е описано по-горе). Осмотичните помпи, свързани към субдурални катетри, имат предимството на непрекъснато и контролирано освобождаване и по този начин обогатяване на цервикалната течност на гръбначния мозък (CSF). Подреждането на субдуралния катетър обаче е предизвикателство, особено по отношение на големи белези, настъпили няколко седмици след нараняването.

    За да се създадат добри тъканни условия за преживяване и интеграция на NPC, няколко проучвания са избрали точки за инжектиране в съседното бяло вещество, 2 mm рострално или каудално спрямо лезията, а не директно в епицентъра на лезията 4,15,18. Там NPC имат по-голям шанс за оцеляване, интеграция и диференциация в астроцити, олигодендроцити и неврони и могат да мигрират към или в лезията, което води до поникване на аксона и подобрена свързаност на аксоните.

    След усвояване на тези техники, този предложен протокол може да бъде приет от отделния потребител в зависимост от неговите нужди и интереси, промени в нивото и тежестта на нараняването, използването на различни видове клетки или растежни фактори или във връзка с други неврозащитни вещества .

    В Белези от кухини и тъкани: В обобщение, комбинираното лечение със SAP и NPC може да предложи нов и обещаващ подход за преодоляване на най-трудните пречки при лечението на SCI.

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Благодарности

    Бихме искали да признаем финансовата подкрепа за тази работа от канадските институти за здравни изследвания (CIHR), фондацията на семейство Крембил, председателя на Халберт по невронна реконструкция и регенерация, Филип и Пеги Дезвирек и Гордън Яо за участия на 2 Клаус Цвекбергер беше подкрепен с безвъзмездна финансова помощ от "Deutsche Forschungsgesellschaft" (DFG).