Техника за запушване на средна церебрална артерия за предизвикване на депресия след инсулт

Обобщение

Тук представяме протокол за предизвикване на депресия след инсулт при плъхове чрез изключване на средната церебрална артерия чрез вътрешната каротидна артерия. Използваме теста за принудително плуване на Porsolt и теста за предпочитане на захароза, за да потвърдим и оценим предизвиканите депресивни настроения.

Резюме

Въведение

Инсултът се нарежда на четвърто място в списъка на доказващите смъртността болести в САЩ от 1, 2, 3, докато причинява най-много увреждания при възрастни в развитите страни 4; Това прави инсулта водещ претендент сред най-добрите здравни проблеми в света. Нормалността при оцелелите с пликове е рядка, като около 15% -40% от оцелелите страдат от трайно увреждане, 20% се нуждаят от институционална грижа 3 месеца след инсулт 5 и около една трета от шестмесечните оцелели се нуждаят и от други да им помогнат. Живот. През всеки ден 6. Смята се, че инсултът също е отговорен за увеличаването на националните разходи за здраве 7. Американската асоциация за сърдечни заболявания изчислява, че свързаните със случая разходи в САЩ са над 50 милиарда долара през 2010 г. 8 .

Инсултът не само причинява дългосрочни вреди, но някои оцелели са склонни да изпитват емоционални и поведенчески разстройства, като деменция, умора, тревожност, депресия, делириум и агресия 9, 10, 11, 12, 13, 14. Повтарящото се психологическо продължение след инсулт е диагностицирана след инсулт депресия (PSD), която се диагностицира при приблизително 40% -50% от оцелелите 15, 16, 17. Индуцираната от инсулт депресия води до повишена заболеваемост и смъртност 18, 19, 20, 21, 22. Патофизиологията на PSD не е напълно изяснена, но изглежда е причинена от няколко фактора и е свързана с увреждания, когнитивни увреждания и лезии на място 23.

Моделът на фокална мозъчна исхемия на плъхове, създаден от MCAO, е най-широко използваният животински модел на инсулт 24, 25, 26, 27. Демонстрацията на въвеждането на PSD при плъхове чрез запушване на MCA чрез ICA използва техники, които минимизират смъртността и вариабилността в модела MCAO.

Основната цел на този протокол е да очертае стъпките за стимулиране на PSD при плъхове чрез изключване на MCA чрез ICA, модифициран модел на MCAO, който намалява смъртността и резултата от променливостта 28. Специфичните цели включват извършване на неврологични и хистологични изследвания (определяне на неврологичния фокусен номер [NSS], обема на инфарктната зона и мозъчния оток), за да се провери ефективността на MCAO и да се използват поведенчески тестове, за да се определи влиянието на тази MCAO процедура върху Развиване на емоционални разстройства, особено PSD.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Комитетът за грижа за животните от университета Бен Гурион в Негев, Израел, одобри всички процедури за лечение и тестване, използвани в този протокол.

1. Подгответе плъховете за пробната презентация

КЛАС: Изберете възрастни мъжки плъхове Sprague-Dawley с тегло 300-350 g.

Плъховете, четири на клетка, във вивариум при 22 ° C и 40% влажност, с обратен 12-часов цикъл светлина/тъмнина (светлина от 8:00 ч. Сутринта) и неограничен достъп до храна и вода.
Случайно разпределете плъховете в две групи, а именно MCAO група (N = 24) и срамна група (N = 19).

2. Подгответе плъховете за операция

3. Хирургия (техниката MCAO)

КЛАС: Направете операция, както е описано от Boyko et al. 28 и използвайте инструментите на McGarry et al. 29 и Uluç et al. 30-ти .

Прокарайте вентрална средна линия и дисектирайте повърхностната фасция.
Внимателно направете рязко и тъп разделяне в трите триъгълни мускула (стернохиоидни, дигастриални и стерномастоидни мускули), за да идентифицирате сънните артерии (ECA, ICA и общата каротидна артерия [CCA]).
Внимателно разглобявайте и излагайте правилните CCA и ICA.
Отделете десния CCA и ICA от блуждаещия нерв.
КЛАС: При идентифицирането на сънните артерии, както е идентифицирано в стъпка 3.2, ICA ще бъде разпознат като половината от клоновете на CCA заедно с ECA.
Поставете катетър (топлинно гравиран или покрит със силикон 4-0 найлон) директно през ICA,

Държавните служители дават 5 ml 0,9% физиологичен разтвор интраперитонеално за всеки плъх, веднага след операция, за да се предотврати дехидратация.
Прилагайте болкоуспокояващи безусловно на първия ден след операцията; Използвайте мелоксикам 1 mg/kg SQ q24 часа. Дайте разреден дипирон (0,5 g, разтворен в 400 ml питейна вода) на плъхове, които показват симптоми на болка през първите 3 дни.
Жертви на плъхове с припадъци (припадъците са причинени от повишеното вътречерепно налягане от мозъчен оток или кръвоизлив 28).

5. Оценка на неврологичната тежест 31

КЛАС: Тази процедура се извършва от двама наблюдатели, които не участват в хирургичната процедура; Те тестват неврологичните дефицити и степента на двигателни дефицити за общ резултат 0-4 32. Този резултат може да се оцени на различни интервали от време; В това проучване е направено 50 минути, 24 часа, 7, 15 и 30 дни след операцията. Ето стъпките за оценка на NSS. Въпреки че не е необходимо в тази ситуация, този резултат е необходим за определяне на инсулт на гризачи, за да се приложи лечение.

Поставете плъха на керамичен под и го оставете да се разхожда свободно за 1 минута.
Внимателно издърпайте плъха назад за опашката и се притеснявате така.
1. Оценете плъха с резултат 0 за липса на неврологичен дефицит.
2. Класирайте плъха с оценка 1 за флексия отпред.
3. Сортирайте плъха с резултат 2 за контралатерален слаб преден крак.
4. Оценете 3-точковия плъх за циркулация от хемиплегичната страна, когато го дърпате за опашката.
5. Посочете плъха с резултат 4 за спонтанно кръжене 32.
  КЛАС: Ако се наблюдава повече от един отговор, се предпочита действието с по-висок резултат.

6. Определяне на инфарктния обем (хистологично изследване)

7. Измерване на мозъчен оток 38

КЛАС: Мозъчен оток е измерен 24 часа след последния MCAO. Евтаназия на животни с тежки неврологични дефицити, които пречат на яденето и пиенето в продължение на поне три дни, над 20% загуба на тегло, хемиплегия или гърчове.

Оценете размера на отока на дясното полукълбо, като използвате компилацията на частично нарязаните области, за да изчислите обемите на дясното и лявото полукълбо в произволни единици (пиксели).
КЛАС: Използвайте софтуера ImageJ 1.37v за това изчисление след оптично сканиране (разделителна способност: 1600 x 1600 dpi). Изберете областта на интерес и използвайте функцията за измерване от менюто за анализ. В нашето разследване бяха използвани макроси.
Изразявайте областта на мозъка обикновено оток като процент от стандартните области в незасегнатото контралатерално полукълбо.
Изчислете степента на подуване, като използвате уравнение 39, разработено по-рано .

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Хистологични находки (маса 1) показаха статистически значим обем на инфаркта като процент от целия мозък в сравнение с животните от пубисната контролна група (p Фигура 2А) и са имали по-дълъг период на неподвижност (p Фигура 2B). В сравнение с срамните плъхове.

Фигура 1: Графична демонстрация на хронологията на дневника. Различните тестове, които се провеждат върху плъхове по различно време, могат да се видят на схемата: MCAO = средно запушване на мозъчната артерия в началото на експеримента; NSS = номер на неврологичен фокус, 50 минути, 24 часа и 7 и 30 дни след MCAO; И тестове за поведение (предпочитания за захароза и тестове за плуване, принудени от Porsolt) от 30 до 33 дни след MCAO. Тази цифра е взета от Ifergane et al. 45 променени. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

Фигура 2: Тест за предпочитание на Sukro, проведен от дни 30 до 33 с пост-MCAO (n = 16) и срамни контролни плъхове (n = 14). Пропорция (%) захароза. Плъховете MCAO консумираха по-малко захароза (стр. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

Фигура 3: Тестът за принудително плуване на Porsolt от дни 30 до 33 след MCAO (n = 16) и след фиктивна процедура (n = 14). Продължителност на движението (в секунди). Времето за неподвижност в теста за принудително плуване беше значително по-дълго в групата MCAO, отколкото в групата Sham (стр. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

Исторически резултати	Близка група за запушване на мозъчната артерия	Срамната група
Целият мозък (обем на инфаркта)	8,8% ± 6,5	0,3% ± 0,1
Мозъчен хема	10,2% ± 4,6	2,6% ± 1,2
Всички данни представляват групата ± S.E.M.

Таблица 1: Хистологични находки за обем на инфаркта и мозъчен оток. MCAO = запушване на средната церебрална артерия (n = 5); Билет (n = 5).

Резултат от неврологичния фокус	Близка група за запушване на мозъчната артерия	Срамната група
50 минути след операцията	2,75 ± 0,14	0,0 ± 0,0
24 часа след операцията	3,2 ± 0,15	0,0 ± 0,0
7 дни след операцията	0,91 ± 0,2	0,0 ± 0,0
Всички данни представляват групата ± S.E.M.

Таблица 2: Неврологичен фокусен номер (NSS) за MCAO и срамни плъхове. MCAO = запушване на средната церебрална артерия (n = 16); Билет (n = 14). Тази таблица идва от Ifergane et al. 45.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Един от начините, по който техниката MCAO, представена тук, може да се разглежда като по-безопасна от оригиналния модел MCAO, е показан, като не засяга ECA и нейните клонове, включително окциденталната артерия, терминалните езици и максиларната артерия. При затваряне на MCA над ICA. Изоставянето на ECA (и неговите клонове) от оригиналния модел MCAO, чрез дисталното отделяне и коагулация на 46, причинява нарушена мастификация, тъй като съдовото снабдяване на мускулите е увредено. 47 Разрушаването на мускула в крайна сметка може да доведе до освобождаване на допълнителна изчислителна динамика на течностите. За разлика от оригиналната техника MCAO, при която достъпът до MCA е чрез ECA, описаната тук техника е модифицирана за инсулт, без да се прекъсва притока на кръв в ECA и нейните притоци.

Основните аргументи в полза на новия модел MCAO пред оригиналния модел MCAO се крият в способността му да намалява значително вариабилността на мозъчния оток, промените в обема на инфаркта и теглото, както и да намалява MCAO-зависимата смъртност. Смъртността в процедурата MCAO е важен фактор 48; Смъртността от 20 процента се счита за разумен 49,50. Степените на смъртност (20% за оригиналната MCAO, 12,5% за новата MCAO и 0% за контрола) в настоящото проучване бяха в приемливия диапазон, но новата MCAO техника се представи по-добре от оригиналната MCAO.

Плъховете, подложени на новата MCAO процедура, са отслабнали веднага след операцията и са натрупали повече килограми в края на изследването, отколкото плъховете, подложени на оригиналната MCAO техника 28. По-голяма загуба на тегло и по-малко наддаване на тегло при плъхове, подложени на оригиналния MCAO, може да бъде резултат от въздействието на връзката на ECA по време на операция, което води до дистална хипоперфузия на лицевите, речевите и долночелюстните артерии и мускулни увреждания от исхемична подкрепа Мастика. Когато мастирането е компрометирано, приемът през устата намалява, което, в съчетание с катаболизъм, може да бъде причина за загуба на тегло и в дългосрочен план за лоши неврологични резултати, заболеваемост и смърт 43. Достъпът до MCA чрез ICA не изисква никаква намеса в ECA и нейните клонове. По този начин не се предизвикват неблагоприятни ефекти по време на новата процедура MCAO и плъховете, подложени на процедурата, не изпитват проблеми с теглото, заболеваемостта или смъртта.

Тестовете, използвани за оценка на основните депресивни фактори като депресивно поведение, анхедония, обездвижване и нарушения на обучението и паметта, са стандартни процедури, използвани при животински модели на депресия от 51, 52. Тестът за поведение, като теста за принудително плуване на Porsolt, често се влияе от необичайни двигателни умения след MCAO. Тук този тест се използва от 30 до 33 дни след операцията, за да се определи, че индуцирането на PSD в модифицираните MCAO плъхове не е повлияло неправомерно техните двигателни умения. Според резултатите, плъховете от тестовата група показват общо поведение при бягство, сравнимо с това на пубисните контролни плъхове. MCAO плъховете са имали значително повече неуспехи да избягат, значително по-продължителна неподвижност и по-ниско предпочитание към захарозата в сравнение с овцете. Това предполага, че тази MCAO техника е способна алтернатива на оригиналния MCAO метод.

Разликата между включването и изключването на плъхове в процедурата MCAO за по-широка експериментална оценка зависи много от резултата от операцията. С модела, свързан с MCAO, индуциран от PSD, могат да се съдържат някои нежелани странични ефекти на MCAO, оставяйки място за включване на по-малки и вероятно по-крехки плъхове в процедурата MCAO. Представеният тук MCAO модел на животни предоставя сценарий за намаляване на нежелани резултати след индуциран от MCAO PSD, тъй като има потенциал да намали вариабилността в промяната на теглото, мозъчния оток и инфарктния обем и свързаните с MCAO смъртни случаи. Тази техника би могла да служи като инструмент за оценка на бъдещи терапии с PSD и предоставяне на предклинични данни за ефикасността на терапевтичните вещества, както и за наблюдение на други фактори, които променят модалностите на клиничния резултат при инсулт и PSD.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.