Пречистване на протеини - Биология

Пречистване на протеини (също Пречистване на протеини) описва процеса на обогатяване и пречистване на един или повече протеини от сложна биологична смес или разтвор, съдържащ няколко биомолекули. Това обогатяване може да се осъществи в няколко последователни стъпки на почистване, като се използват различни методи за почистване, чиято ефективност (смислената последователност) и тяхната ефективност (степента на почистване) се наблюдават и определят количествено с аналитични методи.

Принципи на разделяне

За да се разделят протеините, човек се възползва от различните им характеристики поради последователността и специфичната структура. При йонообменната хроматография и изоелектричното фокусиране това е изоелектричната точка, в SDS-PAGE молекулната маса и пост-транслационните модификации, хроматография за изключване на размера и центрофугиране на молекулната маса и конформация. Изопикното центрофугиране се отделя на базата на плътността. Афинитетната хроматография използва разликите в афинитета към селективен лиганд или в съответните константи на дисоциация. Хидрофобната, обратната фаза и полярната хроматография се разделят според полярността на различните изложени полярни аминокиселини и пост-транслационни модификации. Утаяването с космотропни соли [1] от серията Hofmeister, водоразтворими органични разтворители или температура се основава на променената разтворимост. Екстракцията с екстрагент (обикновено различна фаза) или полиетилен гликол [1] се основава на полярността и различните разтворимости в разтворител или детергент, като напр. Б. Смеси от фенол, хлороформ и изоамилов алкохол (със или без хаотропи като гуанидиниев тиоцианат [2]) или фазово разделяне на един процент (m/V) разтвори на Triton X-114 при 4 ° C. [3] [4] [5] [6]

Обикновено се извършват няколко метода последователно, изборът на метода зависи от свойствата на протеина, съответния метод, зависим от интерфериращите съпътстващи вещества за последващи процедури и всяка свързана денатурация. По-високите степени на пречистване (или пречистващи фактори) на даден процес позволяват по-малък брой етапи на пречистване, напр. Б. с тандемно афинитетно пречистване.

Тъй като протеините, които трябва да се пречистят, най-вече рекомбинантните протеини, са застрашени от инактивация, денатурация или протеолиза по време на разрушаване на клетките, пречистването на протеини често се извършва бързо при 4 ° С в присъствието на протеазни инхибитори. Някои протеазни инхибитори се използват само ако функцията на протеина, който трябва да се пречисти, не е нарушена или поддържането на неговата функция е незначително, тъй като те могат да модифицират протеина чрез ковалентна връзка.

Процес на разделяне

Хроматография

Йонообменна хроматография (IEX)
Хроматография за изключване на размера (SEC)
Афинитетна хроматография
полярна хроматография
Хидрофобна хроматография с взаимодействие (HIC) и хроматография с обратна фаза (RPC)

Електрофореза

Извличане и валежи

серийни извличания
серийни валежи

Филтрация

диализа
Филтриране по тангенциален поток
Микрофилтрация

утаяване

Центрофугиране
Тестове за изтегляне
с помощта на антитела: MACS, анализи на мъниста и имунопреципитация

Изпаряване

Процедура за проверка

След отделните етапи на пречистване на протеините, пречистените протеини се характеризират и определят количествено. Ефективността на цялото пречистване се определя от баланса, със степен на пречистване (като реципрочна на масовата част) от протеиновата маса, или - в случай на ензими - също степен на пречистване може да се определи от ензимните дейности, напр. Б. коефициент на общата маса на пречистения протеин и изходната маса на въпросния протеин в изходния материал или аналогичното коефициент, образувано с дейностите.