Ендодермалният, чернодробен диференциален потенциал. на възрастни и ембрионални стволови клетки in vitro и in vivo

1 Потенциалът за ендодермална, чернодробна диференциация на възрастни и ембрионални стволови клетки in vitro и in vivo, представен от завършилата биотехнология Аника Вулф-Голдънбърг от Берлин от Факултет III Процесни науки в Техническия университет в Берлин за академичната степен на доктор на инженерните науки - Dr. Ing. - Одобрена дисертация Докторска комисия: Председател: проф. Д.ик.н. Д-р U. Stahl Репортер: проф. Д-р Репортер на R. Lauster: Dr. хабил. И. Фихтнер репортер: проф. Д-р J. Kurreck Ден на научната дискусия: 30 март 2010 г. Берлин 2010 D 83

2 Виждаш ли, Момо, каза уличната машина на Бепо, това е така: Понякога ви предстои много дълъг път. Мислите, че е толкова ужасно дълъг; никога не можеш да направиш това, мислиш си. И тогава започваш да бързаш. И човек бърза все повече и повече. Всеки път, когато погледнете нагоре, можете да видите, че това, което предстои, не става по-малко. И се опитвате по-усилено, страхувате се и в крайна сметка сте напълно без дъх и вече не можете. И пътят все още е пред вас. Не можете да го направите така. Никога не бива да мислите за цялата улица наведнъж, разбирате ли? Трябва само да се мисли за следващата стъпка, след това за следващия дъх, следващия удар на метлата. И винаги само до следващия. Тогава е удоволствие; това е важно, тогава си вършите добре работата. И така трябва да бъде. Изведнъж осъзнавате, че сте направили целия път стъпка по стъпка. Дори не сте забелязали как и не сте останали без дъх. Това е важно. Майкъл Енде, от Момо За моите родители, защото ти ме научи да ходя по улицата смело и уверено.

5 S u m e n g e s u n t 5 от клетките. Не е постигната обаче ясна диференциация във функционален хепатоцит. Избраните in vitro условия за индуциране на диференциация на кондиционираната среда и на кокултурата позволяват на CD34 + клетките леко да се диференцират в чернодробни ендодермални клетки. Ендодермалната чернодробна диференциация може да бъде индуцирана в човешки ембрионални стволови клетки от линията SA002 от системите in vitro. Избраните in vitro условия показват, че директният контакт в съвместната култура може да предизвика диференциация по-ефективно от кондиционираната среда в стволовите клетки. Необходимо е обаче да се подобрят съществуващите протоколи за диференциация. Разработените in vivo модели формират основа за тестване и сравняване на in vitro диференцирани клетки.

11 Въведение 11 1 Въведение 1.1 Преглед на различните видове стволови клетки и техните свойства Стволовите клетки се определят въз основа на два критерия (Verfaillie et al., 2002): способността да се самообновява и потенциалът да се развият в различни типове клетки. В зависимост от онтогенетичната възраст се прави разграничение между два вида стволови клетки: ембрионални и възрастни стволови клетки с различен потенциал за диференциация на тоти-, плюри-, мулти- или унипотентност (виж Фигура 1). Фигура 1 Типове стволови клетки с техния потенциал за диференциация Една единична тотипотентна стволова клетка има неограничен потенциал за диференциация и способността да се развива в цялостен организъм. Плурипотентни стволови клетки

56 Рекции 56 показват апоптоза. Някои гени участват в клетъчната пролиферация, свързването на цитокини, репликацията на ДНК, хемотаксиса и хематопоезата (приложение). Таблица 10 Избрани надрегулирани профили на генна експресия на CD34 + клетки след 10 дни култивиране в среда StemSpan, в кондиционирана среда Gherardi и в кондиционирана среда Sautin в сравнение с некултивирани стволови клетки. Термин ген без StemSpan-Medium Condi. Gherardi-Medium Kondi. Саутин средно% p Ген не% p Ген не% p GO:

клетъчна% 5.54E% 1.41E-06 пролиферация GO:

мононуклеарна %% клетъчна пролиферация GO:

митоза% 1,19E% 3,54E% 8,55E-22 GO:

ДНК репликация %% 5.24E + 10 GO:

клетъчен цикъл% 2.16E% 3.23E% 7.13E-16 GO:

апоптоза% 5.56E% 4.75E% GO:

клетъчна диференциация %% GO:

механорецепт или диференциация %% GO:

лизозома% 6.67E% 1.49E% 3.57E + 02 GO:

57 Резултати 57 Стволови клетки, култивирани в кондиционирана саутинова среда, експресират подобен брой гени като стволови клетки в кондиционираната среда Gherardi, 604 надрегулирани гена и 1126 понижени регулирани гени в сравнение с некултивираните стволови клетки. В по-голямата си част гените, които принадлежат към клетъчния цикъл, външен стимул, хормонална стимулация и стероидна биосинтеза бяха регулирани нагоре (приложение). Имаше и натрупване на гени, свързани с микротубулно-цитоскелетна организация и биогенеза, като MID1IP1 и KIF11. Гените от групите епидермално развитие, фокална адхезия, кръвосъсирване и кръвообращение също се изразяват по-усилено. В тази среда бяха открити повечето клъстери с високи профили на транскрипция за клетъчния цикъл, репликация на ДНК и хромозоми и много малко за апоптоза. Регулираните надолу сигнални пътища са адхерен кръстовище, молекули на клетъчна адхезия и сигнални пътища на В-клетъчни рецептори. Освен това, гените, които принадлежат към ядрото, свързване на транскрипционен фактор, ангиогенеза, свързване на MHC клас I и производство на хемокини, се изразяват по-малко, отколкото в некултивираните стволови клетки. Експресията на избрани гени от функционалното групиране GO:

58 Резултати 58 Таблица 11 Промени в генната експресия на избрани гени от базата данни GOTERM_BP_ALL и функционалното групиране: GO:

61 Резултати 61 ранни ендодермални маркери като SOX17 се експресират след кратък период на култивиране, а по-късните маркери като албумин се експресират на ниско ниво в стволовите клетки след по-дълъг период на култивиране. Таблица 12 Съвместно култивиране на CD34 + стволови клетки с AML12 клетки. Mrna се изолира в определени моменти и избраните гени се определят с помощта на полуколичествена RT-PCR (TaqMan). Показано е, че съвместната култура с AML12 клетки регулира надолу CD34 + клетките надолу регулира генната експресия на CD34 и ендодермалните маркери се повишават леко. Gen 0d 7d 21d CD SOX FOXA AFP CEBPA HNF4A -/+ -/+ n.a. ALB -/+ -/+ + KRT n.a. KRT n.b. GATA4 - - не. CDH n.b. GJB1 -/+ ++ n.a. GJA n.b. KRT n.b. Легенда: qrt-pcr: ++++ CT 0.0-4.0; +++ CT 4.1-8.0; ++ CT 8.1-12.0; + 12,1-16,0;

Ако резултатите се увеличат с 64, животните се облъчват с 1,6 Gy от 137 цезий-γ източник. Нулевите мишки NOD/SCID/IL2Ry също понасят тази доза облъчване. Тимусните жлези на имунодефицитни NOD/SCID мишки са много малки в сравнение с имунокомпетентна NMRI мишка като контрола. Те също така не показват ясно разделяне на костния мозък и кортикалните зони и са хипопластични (Фигура 12). В тимусната тъкан само много малко лимфоцити са били видими периваскуларно при имунодефицитните опитни животни. Тимусът на нулевите мишки NOD/SCID/IL2Ry прилича на тимуса на мишките NOD/SCID. a b Фигура 12 Хистопатологично изследване на тимуса на имунокомпетентна NMRI мишка (a) и имунодефицитна NOD/SCID мишка (b).

66 резултата 66 a% HLA-I положителни човешки клетки (нормализирани), 7 3,2 3,1 2,2 1,7 1, мин 30 b 80 A 1 A 2 A 3 A 4 60 A1,1 A Средно AB 1 B 2 20 B 3 B 4 Средно B 0% човешки клетки c 20% човешки клетки Костен мозък PBS SCF дни след iv приложение Слезка PBS SCF дни след iv приложение Фигура 13 Зависим от времето кръвен клирънс на системно приложени CD34 + клетки при NOD/SCID мишки ( а). 4x10 5 CD34 + клетки бяха i.v. трансплантирани в облъчени мишки. Необработените (плътна, синя линия) или SCF предварително обработени клетки (пунктирана, червена линия) се анализират чрез FACS в миши кръвообращение след 1, 5 и 20 минути след приложението. Определен е броят на човешките HLA-I положителни клетки от погълнатите клетки. Резултатите са резултат от общо три експеримента. Дългосрочно присаждане на нетретирани и SCF предварително третирани стволови клетки в NOD/SCID мишки (b, c). Нелекуваните и предварително обработени SCF клетки бяха i.v. прилага се и костният мозък (b) и далакът (c) се анализират чрез поточна цитометрия с човешкото специфично антитяло HLA-I. Стойностите са средни стойности ± SEM на 6-9 мишки на група.

88 A b c 2µm d e stiotions 88 a b c 2µm d e Фигура 27 Изразяване на маркери за плюрипотентност върху недиференцирани стволови клетки SA002. Имуноцитометрично определяне на SSEA-4 (a), TRA-1-60 FITC (b) и Oct-4 (d). Недиференцирани клетки SA002 на ултраструктурно ниво (c). Клетките се характеризират с голямо съотношение ядро-плазма (ядро тъмно). Кариограма на SA002 стволови клетки p41; Гемза петно (д). Описаният кариотип 47, XX + 13 може да бъде открит за клетките. За да се провери стабилният кариотип по време на дългосрочно култивиране, бяха проведени анализи на кариотипа върху ембрионалната стволова клетъчна линия SA002. Анализът и определянето на кариограмата са извършени от компанията IMMD Berlin. Линията на стволовите клетки се култивира с пасаж 18 и се преобразува механично 23 пъти до първия анализ. SA002-