Проучвания и доклади от конференции от Държавната агенция по околна среда. Том 49. Влияние на пестицидите върху хвърлянето на хайвера и ларвите на земноводните

Проучвания и доклади от конференции на Държавната агенция по околна среда Том 49 Влияние на пестицидите върху хвърлянето на хайвера и ларвите на земноводните

Проучвания и доклади от конференции Том 49 Влияние на пестицидите върху хвърлянето на хайвера и ларвите на земноводните на примера на хербицид (изопротурон) и инсектицид (циперметрин)

5.1.2 Параметри на водата 27 5.1.3 Амфибиен спектър 27 5.2 Поглъщане на 14 маркирани със С вещества 28 5.2.1 Поглъщане при хвърляне на хайвера 28 5.2.1.1 Изопротурон 28 5.2.1.2 Циперметрин 28 5.2.2 Кинетика на поглъщане в ларвите 29 5.2.2.1 Изопротурон 29 5.2.2.2 Циперметрин 29 5.2.3 Метаболити на изопротурон 30 5.3 Токсичност 31 5.3.1 Скорост на излюпване и тератогенност 31 5.3.1.1 Изопротурон 31 5.3.1.2 α-циперметрин 31 5.3.2 Увреждане на ларвите 31 5.3.2.1 Изопротурон и търговски продукт TOLKAN FLO 31 5.3.2.2 α-циперметрин 32 5.3.3 Чувствителност на определени фази на развитие 32 5.3.3.1 Изопротурон 32 5.3.3.2 α-циперметрин 33 5.4 Биотрансформация 34 5.4.1 Изопротурон 34 5.4.1.1 Чиста активна съставка 34 5.4.1.2 Търговски продукти 35 5.4.1.2. 1 TOLKAN FLO 35 5.4.1.2.2 FENIKAN 36 5.4.2 Циперметрин 37 5.4.2.1 Активни съставки 37 5.4.2.1.1 Циперметрин 37 5.4.2.1.2 α-циперметрин 39 5.4.2.2 Търговски продукт 40 5.4.2.2.1 FASTAC SC 40 6 Дискусия 41 6.1 Полеви проучвания 41 6.2 Поглъщане на активни пестицидни съставки ffe 42 6.3 Токсичност 43 6.4 Биотрансформация 46 6.4.1 Изопротурон 46 6.4.2 Циперметрин 49 6.5 Енергийни съображения 51 6.6 Управление 52 7 Заключения 54 8 Литература 56 Публикации I-IV 64 СЪДЪРЖАНИЕ 3

Фиг. 3: Химична структура на 8-те стереоизомера на циперметрин. α-циперметринът е рацемат на двата опаковани цис изомера. По-високите норми на приложение на циперметрин (100 g/ha), например, доведоха до измерване на концентрация на активна съставка от 100 µg/l 4 h след пръскане на малки водни тела на дълбочина на водата 2,5-10,0 cm (CROSSLAND, 1982). Веднага след приложението, 24 mg/l циперметрин бяха открити в изключително тънкия повърхностен филм (0,05 mm); в рамките на една седмица стойностите паднаха до 50 µg/l. В рамките на първия час след сухоземното приложение на циперметрин в лозе, 0,2 до 1,7 µg/l циперметрин беше открит в съседна канавка точно под водната повърхност (BENNETT et al., 1980). Не са наблюдавани поведенчески аномалии или летални ефекти при популациите риба и земноводни от свободно отглеждане. ВЪВЕДЕНИЕ 11

Фиг. 4: Възможна първа стъпка в метаболизма на циперметрин чрез разцепване на естерната връзка. Има също така индикации за биотрансформацията на циперметрин чрез конюгация към глутатион (фаза II) след предишно окисление от цитохром Р-450 зависими монооксигеназни ензимни групи от фаза I (DAVIES) и др., 1994). Вездесъщият GST е в състояние да катализира конюгацията на различни електрофилни компоненти, включително хербициди и инсектициди, с глутатион (HAYES & WOLF, 1988; BUCCIARELLI et al., 1999; GLÄßGEN et al., 1999), демонстрирайки разнообразието на Илюстрирани изоензими. Повечето от GST изоензимите се разтварят в цитозола (т.нар.). Свързан с мембрана GST (mgst) може да бъде изолиран от чернодробната тъкан на различни бозайници (напр. Плъхове; DEJONG et al., 1988), а също и от черния дроб на нокътната жаба (SUN et al., 1998). Цитозолните изоензими са разделени на поне шест различни класа въз основа на сходни аминокиселинни последователности и субстратни специфичности: α, µ, π, θ, ζ и σ (EATON & BAMMLER, 1999). В сравнение с GST за бозайници, относително малко се знае за земноводните (BUCCIARELLI et al., 1999). Предишни изследвания, насочени към изолиране и идентифициране на различни GST изоензими при земноводни (DI ILIO et al., 1992; GRUNDY & STOREY, 1998). Промяна в модела на GST при земноводните между ембрионалния стадий и възрастния е описана за Bufo bufo; някои изоензими, принадлежащи към π-класа на по-късните етапи на развитие (bbgst P2-2) изглежда са по-ефективни срещу токсичните ефекти на реактивните метаболити на ксенобиотиците (BUCCIARELLI et al., 1999). Следователно, в рамките на представената тук работа, трябва да се изследват ефектите от излагането на пестициди върху активността на GST в различните етапи на развитие на земноводните. 3.4 Тестови организми Тестът FETAX (Frog Embryo Teratogenesis Assay-Xenopus Test; DAWSON & BANTLE, 1987) в момента се използва като стандартизиран инструмент за изследване на голям брой биологични процеси в 14 ВЪВЕДЕНИЕ

4 Материал и методи 4.1 Материал 4.1.1 Оборудване Устройство HPLC с 996 диоден детектор с решетка LiChrospher 100 RP-18 колона (250 x 4 mm; 5 µm) предпазна колона (4 x 4 mm) Spherisorb ODS колона (250 x 4.6 mm; 2-ра, 5 µm) HPLC с [14 C] итриев стъклен сцинтилационен брояч Spherisorb ODSII колона (250 x 4.6 mm; 3 µm) измервател на проводимост ph-метър ротор 70.1 кислороден измервателен сцинтилационен брояч LSC 1900 TR сцинтилационен брояч 1409 Sep-Pak екстракционни колони спектрофотометър Uvikon 922 ultracentrifuge L-60 Фотометър PT-3 Фотометър Производител Waters Merck Merck Sykam Shimadzu Berthold Merck WTW WTW Beckman WTW Packard Wallac Waters Kontron Beckman Macherey & Nagel Uvicon 4.1.2 Радиохимикали Химично наименование Специфична дейност Продажби 14C- IPU 3- (4-изопропил- [14 C] -фенил) - 3.965 MBq/mg Международен изотоп 1,1-диметилурейна чистота> 97% Германия 14C- Циперметрин R-циано-3-феноксибензил (1R) - 4.625 MBq/mg Международен изотоп cis-3 (2.2- дихлоровинил) -2,2- чистота> 95% Германия дим етил [14 С] циклопропан карбоксилат 18 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ

4.1.3 Химикали Химично наименование Продажби α-циперметрин R-циано-3-феноксибензил (1R) -цис-3 (2,2-дихлоровинил) - Fluka 2,2-диметилциклопропанкарбоксилат Брадфордски реагент Sigma Brij-35 полиоксиетилен лаурилов етер Fluka CaCl 2 калциев хлорид Merck CDNB 1-хлоро-2,4-динитробензол Fluka CH 3 CN ацетонитрил Roth CH 3 OH метанол Roth циперметрин R-циано-3-феноксибензил (1R) -цис-3 (2,2-дихлоровинил) - Fluka 2,2-диметилциклопропанкарбоксилат DCNB 2,4-дихлоро-1-нитробензен Fluka Diflufenikan Fluka DTE дитиоеритритол Sigma EDTA етилендиаминтетраоцетна киселина Sigma FASTAC SC BASF FENIKAN Bayer флуородифен 4-нитрофенил-2,2-nitrofluor-methylphenylether Fluka Глицерол Sigma GSH глутатион Sigma (4-IP) -1,1-диметилурея Fluka морска сол Aquarienhandel Na 2 HPO 4 Динатриев хидроген фосфат Sigma NaH 2 PO 4 Натриев дихидроген фосфат Sigma NaHCO 3 Натриев хидроген карбонат Merck NAP-10 Sephadex G-25 колони Amersham-Pharmacia TOLKAN FLO Bayer 4.1.4 Буфер натриев буфер на буфер натриев фосфат r, 0,1 M, pH 6,5 микрозомен буфер: натриев фосфатен буфер, 20 mm, pH 7,0 20% глицерол 1,4 mm DTE 1 mm EDTA 20% глицерол 1,4 mm DTE Цитозолен буфер: натриев фосфатен буфер, 20 mm, pH 7, 0 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ 19

В хода на курса съдържанието на радиоактивно вещество в ларвите отново е намаляло значително и след 24 часа експозиция достига 59,12 ± 1,62 ng циперметрин/mg прясно тегло, почти стойностите на контролата (53,65 ± 3,31 ng циперметрин/mg прясно тегло) и остава постоянна (фиг. 10). В ларвите на R. arvalis се наблюдава бързо поемане и последващо елиминиране на 14-С-белязания циперметрин. Във фазата на елиминиране беше измерено увеличение на съдържанието на радиоактивно белязани въглеродни съединения в средата, което трябва да бъде неконвертиран 14-маркиран циперметрин и/или неговите метаболити. 5.2.3 Изопротуронови метаболити Чрез сравняване на времето на задържане на 14-маркираните с С метаболити на B. bombina и B. variegata с тези на оригиналните стандарти, могат да бъдат открити няколко метаболити на IPU и при двата вида, като N-деметилираното производно MDM-IPU, С-хидроксилираните производни 1-OH-IPU, 2-OH-IPU, 1-OH-MDM-IPU и 2-OH-MDM-IPU и олефиновият метаболит изопропенил-IPU (Фиг. 11, Публикация I). Фиг. 11: Схема на метаболизъм на изопротурон съгласно HAAS (1997) Рамковите метаболити са открити в изследването, представено тук. 30 РЕЗУЛТАТА

8) За обработването на земеделски площи в центрове за разпространение на чувствителни видове земноводни са необходими по-екологични производствени методи. В допълнение към благоприятстването на интегрираната растителна защита и използването на технология за намаляване на отклоненията, се препоръчва създаването на обрасли буферни ленти около водното тяло (с минимална ширина 20 m). Програма 2000 предлага инструменти за компенсационни плащания в райони, засегнати от екологични ограничения. ЗАКЛЮЧЕНИЯ 55

Съкращения 1-OH-IPU 1-Hydroxy-IPU 1-OH-MDM-IPU 1-Hydroxy-Monodesmethyl-IPU 2-OH-IPU 2-Hydroxy-IPU 2-OH-MDM-IPU 2-Hydroxy-Monodesmethyl-IPU B bombina Bombina bombina B. variegata Bombina variegata BCF биоконцентрационен фактор BSA говежди серумен албумин, фракция V CDNB 1-хлоро-2,4-динитробензен; Фотометър субстрат CP цитозолен буфер CPA циклопропанкарбоксилна киселина DCNB 2,4-дихлоро-1-нитробензен; Фотометров субстрат DTE Dithioerytrithol FFH Фауна-Флора-Хабитат GSH Глутатион GST Глутатион S-Трансфераза HPLC Течно хроматография под високо налягане IPU Isoproturon kat Katal, единица за ензимна активност KO/W Коефициент на разпределение октанол/вода MDM-IPU мономесметил MPU mg Микрозомен буфер NaP натриев фосфатен буфер PBA феноксибензенова киселина R. arvalis Rana arvalis т. Нар. Разтворим глутатион S-трансфераза 62 СЪКРАЩЕНИЯ