Методи за изследване на свързването на лиганд. Равновесна диализа

Методи за изследване на лигандни връзки Равновесен диализен модул Ензимна кинетика: Ръководител: проф. Ханс Бисвангер Надзор: Елена Кракер Протокол за теста: Паула Квеке Стефан Могк Страница 1 от 15

Картина на корицата: Блок за диализа Илюстрацията е схематична и не се отнася до продукти, които действително се предлагат на пазара. Показаният блок е разделен на две клетки, които са отделени от мембраната във вътрешна и външна камера. 1 Индекс 1.1 Съдържание 1 Индекс. 2 1.1 Съдържание. 2 1.2 Списък на фигурите. 2 2 Въведение. 3 3 Материал и методи. 3 3.1 Химикали и инструменти. 3 3.2 Индол тест. 4 3.3 Равновесна диализа. 5 4 Експериментална част. 7 4.1 Калибриране на теста с индол. 7 4.2 Определяне на времето за диализа. 8 4.3 Извършване на равновесна диализа. 10 5 Резюме и дискусия. 14 6 Литература. 15 1.2 Списък на фигури Фигура 1: Оцветяване с индол с реагент на Ерлих. 4 Фигура 2: Как работи равновесната диализа. 5 Фигура 3: Възможни методи за оценка. 6 Фигура 4: Калибриране на теста за индол. 8 Фигура 5: Определяне на времето за диализа. 9 Фигура 6: Разпределение на индол (изчезване) след диализа. 12 Фигура 7: Разпределение на индол (концентрация) след диализа. 12 Фигура 8: Оценка чрез пряко приложение. 13 Фигура 9: Оценка с използване на двойно реципрочно представяне. 13 Фигура 10: Оценка на Scatchard. 14 Страница 2 от 15

Предаване T = I/I 0 [] (1) Абсорбция A = 1-T [] (2) Изчезване E = ε * c * d [] (3) E = log 1/T (4) ε: коефициент на екстинкция c: Концентрация d: Дебелина на слоя 3.3 Равновесна диализа Диализната клетка е разделена на външна и вътрешна камера от полупропусклива мембрана с определен размер на порите: Фигура 2: Как работи равновесната диализа могат да бъдат радиоактивно маркирани според лиганда) в различни концентрации. Мембраната е пропусклива само за лиганда с ниско молекулно тегло (граница за изключване на ключови думи), градиентът на концентрация се балансира чрез дифузия. Лигандът, свързан от макромолекулата, се изтегля от равновесието и се замества с лиганди, вливащи се, докато свободните части на лиганда в двете камери се изравнят. В равновесие се прилага следното: [лиганд, отвън] = [лиганд, отвътре, свободен] (5) [лиганд, отвътре, общо] = [отвътре, свободен] + [отвътре, обвързан] (6) 5 в 6 [Отвътре, обвързано] = [отвътре, общо] [лиганд, отвън] (7) страница 5 от 15

4 Експериментална част 4.1 Калибриране на теста за индол За да може да се изчисли концентрацията на индол от измерената абсорбция, е направена серия от разреждания с известни количества индол и тестът за индол е извършен, както е описано. Концентрациите в диапазона около константата на дисоциация са умишлено избрани за серията разреждания. Таблица 1: Калибриране на теста за индол Индол 1: 100 KPP (1000 µm) (0,1 M) V [µl] V [µl] c [µm] E [] *) (572 nm) 0 250 0 0,000 5 245 20 0,041 10 240 40 0,082 15 235 60 0,110 20 230 80 0,159 (Kd = 100 µm) 25 225 100 0,207 50 200 200 0,363 Концентрация в диапазона 75 175 300 0,507 1/10 Kd