Измерване на продължителността на живота в Drosophila melanogaster doi: 10.3791/50068 Публикувано: 7 януари 2013 г.

Обобщение

Drosophila melanogaster е мощен модел за изследване на молекулярната основа на регулирането на дълголетието. Този протокол ще обсъди стъпките, свързани с генерирането на възпроизводимо измерване на продължителността на живота въз основа на населението, както и потенциалните клопки и как да ги избегнем.

Резюме

Стареенето е феномен, който води до стационарно физиологично влошаване на почти всички организми, в които е изследвано, което води до намалена физическа работоспособност и повишен риск от заболяване. Индивидуалното стареене се проявява на равнището на населението като увеличение на свързаната с възрастта смъртност, което често се измерва в лабораторията чрез наблюдение на продължителността на живота в големи кохорти от хора на същата възраст. Експериментите за опит за количествено определяне на степента, до която генетичните или екологични манипулации влияят върху продължителността на живота при прости моделирани организми, са изключително успешни за разбиране на аспектите на стареенето, които са от значение за таксоните, и за вдъхновяване на нови стратегии за удължаване на живота и предотвратяване на свързаните с възрастта заболявания при бозайниците са запазени .

Протокол

Препоръчваме да съхранявате експериментални храни, дрожжева паста и плочи от гроздов агар, които се появяват в протокола при 4 ° C и да ги използвате в рамките на 1-2 месеца, стига да не са зададени форма и сухота. Стандартните условия на околната среда както за ларвите, така и за възрастните включват поддържане на Лети в инкубатор при 25 ° C с 12:12 h цикъл светлина-тъмнина и 60% относителна влажност.

А. Подготовка за експериментално готвене

За растежа на ларвите използваме модифициран Caltech Medium 5, който в този протокол е съкратен като CT.
Препоръчваме диета за възрастни дрозофили (SY), която се състои от захар (захароза) и мая (лиофилизирана пълноценна бирена мая) в 2% агарова основа, която е сварена, допълнена с антибиотици и противогъбични средства и диспергирана (10 ml на флакон) 6. Храната трябва да се остави да се втвърди и да се изпари за 12-24 часа преди съхранение. Тъй като хранителната среда може значително да повлияе на дълголетието, последователните методи на готвене са от съществено значение както в рамките на експеримента, така и за сравнение между експериментите.
Ако трябва да се добави фармакологичен агент към храната за възрастни, това лекарство може да се смеси в малка порция храна и да се наслои (2 ml) върху хранителната повърхност с контролни флакони, съдържащи слоеве от носител.

2. Пригответе жива дрождова паста

Смесете 5-6 мл вода с 3 г суха мая и разбъркайте добре. Консистенцията на маената паста трябва да е такава, че за гладко фъстъчено масло.

3. Пригответе плоча от гроздов агар

Добавете опаковка от премикс от гроздов агар в 500 ml дестилирана вода в бутилка от 1000 ml и следвайте указанията на опаковката, за да разтворите сместа от гроздов агар.
Внимателно изсипете дебел слой смес в 100 mm чашки на Петри, като избягвате да шупне. Опаковка Premix произвежда около 14 плочи от гроздов агар.
Оставете медията да се охлади и втвърди при стайна температура с включен капак за 15 минути. Плочите могат да се съхраняват при 4 ° C, да се опаковат в найлоново фолио или да се използват незабавно.

4. Колекция от синхронизирани яйца

Всички среди, използвани в този протокол, т.е. мая, плочи от гроздов агар, CT и 10% SY храни, трябва да са със стайна температура.

5. Колекция от възрастни мухи, съвпадащи с възрастта

Възрастните обикновено се излюпват 9 нататък от първия ден. Изхвърлете мухите, появили се през първия ден, и поставете бутилки обратно в инкубатора за една нощ. Тази практика ще избегне случайни избори за започване на аварийни ситуации и за събиране на максимален брой синхронизирани мухи.
16-22 часа по-късно, еднодневният възрастен лети в 10% SY бутилки с храна. Ако е необходимо, друга партида може да бъде събрана на следващия ден.
Мухите се връщат обратно в инкубатора и позволяват на мухите да достигнат полова зрялост и да се чифтосват за два дни. Запишете деня на трансфера на 10% SY бутилки като първия ден на зряла възраст.

6. Сортиране на мухи и настройване на експеримент за дълголетие

Анестезирайте малки групи мухи върху подложката за упойка, след това сортирайте мъжете и жените на две групи с четка. Когато се използва CO 2, е от решаващо значение да се сведе до минимум излагането на възможни дългосрочни здравословни проблеми, които могат да нарушат целостта на експеримента за дълголетие.
Поставете 30 мухи от същия пол в отделни флакони. Ако не приемем балансиращи хромозоми в популацията и здрави потомци, всяка бутилка трябва да произвежда приблизително 3-4 флакона от всеки пол. Аликвитирането на мухи в отделни флакони не трябва да надвишава 3-4 минути, така че през цялото време мухите са изложени на анестезия само за максимум 9-10 минути.
Повторете стъпките, докато 6.1-6.2 има 8-10 повторения на флакона за всеки пол и експериментална терапия.

7. Настройте електронната таблица на Excel за проследяване на експеримента за дълголетие

Препоръчваме рандомизиране на позицията на флакона, вместо да групирате флаконите по експериментални условия, за да се избегне изкривяване в позицията на флакона в инкубатора и да се скрие идентичността на флакона на експериментатора. За да направите това, първо присвойте рандомизиран цифров идентификатор на всеки флакон в програма за електронни таблици, след което подредете флаконите в тави по идентификационен номер. Ако използвате софтуера за управление на експеримента dLife, следвайте инструкциите за настройка на експеримента, за да генерирате идентификационния номер за всеки флакон.
(По избор) Ако използвате RFID четец или четец на баркодове в сътрудничество с dLife, прикрепете RFID или баркод маркер към всеки флакон и свържете маркера с ампулата с цифровия идентификатор в dLife. Програмата разпознава всеки флакон, когато се сканира с четец, и започва да записва данните на правилното място в таблица. Използването на четец на маркери във връзка с dLife намалява времето за улавяне на данни и грешки при запис.

8. Поддържане на експеримента за дълголетие

Флаконите с прясна храна трябва да са със стайна температура за всяко прехвърляне.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Опростена схема на протокола е в илюстрация 1, където са очертани важни стъпки. Синхронизиращата част на протокола може да изисква адаптирани към възрастта мухи за възрастни за различни анализи.

Типичните криви на степента на оцеляване от мухи от див тип са показани в Фигура 2а показан с помощта на софтуера за управление на експерименти dLife (Фиг. 2б, в). Възрастните мъже живеят предимно по-кратък живот, и двете популации постигат средно и средно дълголетие> 50 дни при 10% SY храна при 25 ° C. Имайте предвид, че оцелелият остава високо в началото на експеримента и след това пада експоненциално.

Продължителността на живота на дрозофилата се влияе от условията на околната среда, като температура и диета. Фигура 3а показва, че възрастните мъже обикновено живеят значително по-малко, тъй като температурата се повишава. По същия начин ефектът от диетата е за цял живот в 3б подаръци: Възрастни женски мухи на по-малко концентрирана диета (5% SY) обикновено живеят значително по-дълго от тези на по-концентрирана диета (15% SY).

Плътността на кохортите по време на развитието може да повлияе на продължителността на живота на възрастните и да промени времето за развитие. Тук показваме пример за това как различните плътности на синхронизираните яйца влияят върху развитието на ларвите. Като в 4 е показано, добивът на мухи при възрастни е лош и повърхността на храната е склонна към изсъхване, когато броят на яйцата е твърде малък. В другия край на спектъра развитието на ларвите се забавя в препълнените бутилки и добивът на възрастни мухи намалява.

Кривата на оцеляване на кохортата като цяло може да бъде значително повлияна от ненормални ефекти върху флакона, както при Фигура 5 показани. Нередовните данни за оцеляването на отделни флакони могат да имат няколко причини, като например лошо качество на храната или натрупване на бактерии/гъбички и инфекция. Докато такива необичайни смъртни случаи не могат да изкривят измерването на популацията, няма проста метрика за адекватно определяне, че флаконът трябва да бъде изключен от експеримента. Следователно тези ситуации е най-добре да се избягват чрез добро боравене и да се смекчат чрез използване на голям обем на пробата.

илюстрация 1. Опростено схематично представяне на анализ на живота на дрозофила.

Фигура 2. (A) Представителни криви на продължителността на живота w 1118, контролиращи женски (кръгове) и мъжки (квадратчета) възрастни мухи при 25 ° C върху SY10% храна. (B, C) Представителни екранни снимки на софтуера dLife.

Фигура 3. Ефекти от температурата (A) и фуража (B) върху продължителността на живота на възрастните. А. Мъжки мухи за контрол на възрастни (Кантон S) се държат при 18 ° C до зряла възраст, 25 ° C или 29 ° CB. Възрастни контроли (w 1118) женски мухи се хранят с 15% или 5% SY SY диета.

Фигура 4. Ден 9 на разработване (при 25 ° C) на синхронизирани яйца, аликвотирани в бутилки с храна за CT. Обемът на съдържащата ембрион аликвотна част е показан като под всяка бутилка.

Фигура 5. Представителен график от софтуера dLife показва степента на оцеляване на флакона. Стрелката показва единичен флакон, необичаен в група.

Фигура 6. Примери за неоптимално качество на храната. А. Мехури на повърхността на хранителната промишленост. Б. Храната се сви от ръба на флакона. В. пукнатини в храната. Г. Натрупване на бактерии на повърхността на храната.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Представеният тук протокол описва метод за извършване на възпроизводими измервания на дълголетието на възрастни при дрозофила, който е адаптивен към оценката на генетични, фармакологични и екологични интервенции. Основните аспекти на протокола включват внимателен контрол върху средата за развитие на ларвите, минимизиране на стреса за възрастни и свеждане до минимум на пристрастията спрямо експерименталните групи и контролите. Представяме също използването на софтуера за управление на експеримента dLife през целия живот. Чрез просто прикачване на баркод или RFID етикет към всеки кораб, програмата ще подпомогне събирането на данни на dLife за всяко измерване и в начертаването на кривата на степента на оцеляване. Въпреки че понастоящем е най-подходящ за изучаване на продължителността на живота на мухите с помощта на флакони, този инструмент за управление на експерименти може лесно да бъде адаптиран за използване в други организми, с различни видове популационни камери или за допълнителни мерки, включително устойчивост на стрес и оцеляване Лекарствена токсичност.

Важните аспекти на контрола върху околната среда на ларвите/какавидите включват избягване на пренаселеността и поддържане на контролирана среда със строго регулиране на светло-тъмни периоди, влажност и температура. Тези фактори влияят както върху развитието на времето, така и върху физическото качество на получените възрастни. Нежеланата среда на ларвите, като висока плътност на ларвите, може да доведе до активиране на фактори, предизвикани от стрес (например експресия на протеин от топлинен шок), за които е известно, че влияят на дълголетието на възрастните 18.

Предложени са алтернативни подходи за хранене за анализ на продължителността на живота, включително подход за капилярна подаваща система (метод CAFE) 23. Този метод се отличава със способността си да осигурява точни измервания на консумацията на храна, но води до значително повече краткотрайни мухи 24. Възможните стресове, свързани с хранителната среда, трябва да се използват при оценка на комбинираната връзка между диетата и генетичните фактори в общото дълголетие ще.

Демографският анализ, включително изчисляването на кривите на оцеляване и смъртност, може да разкрие много информация за динамиката на застаряването на населението. Типичната крива на оцеляване ще остане относително равна за продължителен период от ранна възраст и ще увеличи скоростта на спад при възрастните жени, което съответства на период на ниска смъртност, последван от период на експоненциално нарастване на смъртността. Стресова среда обикновено се проявява като излишък от преждевременни смъртни случаи сред населението и необичайно спадане в кривата на оцеляване. Въпреки че такъв резултат може да даде значителни разлики между леченията, той обикновено няма да бъде стабилен за репликация. Ето защо препоръчваме да се извършат поне два независими (т.е. нетрайни) експеримента за повторение, преди да се направи твърдо заключение. Може да са необходими допълнителни усилия за увеличаване на размера на пробата, контрол на условията на отглеждане и подобряване на здравето на родителите родители.

Дясната цензура (отстраняване на животни от експеримента, за които се подозира, че са избягали или умрели от случайни причини) на животни, които умират от стресиращи условия на околната среда, трябва да се прилага с изключително внимание. Строго погледнато, апаратът за цензура трябва да се случва произволно при експериментални лечения и ако експерименталният интервент модулира чувствителността към стреса, може по невнимание да се приложи селекция на ниво лечение спрямо населението. Като общо правило избягването на наличието на двусмислени фактори, които могат да причинят ранна смърт (особено свързано с източника на храна) е по-добро от устройството за цензура и устройството за цензуриране трябва да се прилага само за организми, наблюдавани да умират или да избягат по време на физическа манипулация.

Последното съображение е оценката на статистическата значимост. Докато големите размери на кохортните проби осигуряват впечатляващи резултати при разграничаването на малки разлики между леченията, трябва да се има предвид и потенциалното биологично значение на такава разлика. При сравнително големи експерименти с дълголетие разликите често са едва 2,1% статистически силно значими, но общото въздействие на интервенцията върху здравословното състояние може да бъде малко. Следователно при интерпретирането на общите резултати от експеримента трябва да се отдаде както статистическо, така и биологично значение. Заключението за процеса на стареене от експерименти за оцеляване може да бъде допълнено от мерки за възрастово намаляване на поведенческите или физиологични здравни мерки, включително способност за катерене 25 и целостта на стомашно-чревната стена 7.

В заключение, моделът организъм на дрозофила е привлекателен избор за изучаване на механизмите на стареене. С внимателна експериментална техника стабилният демографски анализ може да даде представа за ефектите на фармакологичните и генетични фактори върху процеса на стареене.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.