Ешерихия коли като пробиотична активна съставка във фармацевтични продукти Молекулярна и функционална характеристика на здравословни щамове

Ешерихия коли като пробиотична активна съставка в лекарствени продукти Молекулярна и функционална характеристика на здравословни щамове ДИСЕРТАЦИЯ за придобиване на академична степен Доктор rerum naturalium (д-р рен. Нар.) На Факултета по математика и естествени науки на Техническия университет в Дрезден, представен от дипломирания биол Анке Цшюттиг, роден на 11.11. .1980 г. в Дрезден, подадено на 27 април 2012 г.

СЪДЪРЖАНИЕ СЪДЪРЖАНИЕ СЪДЪРЖАНИЕ. СПИСЪК НА СЪКРАЩЕНИЯТА. E СПИСЪК НА ФИГУРИТЕ. H ИНДЕКС НА ТАБЛИЦИТЕ. J 1 ВЪВЕДЕНИЕ. 1 1.1 Човешката чревна микрофлора. 1 1.1.1 Състав и функция на чревната флора. 1 1.1.2 Ролята на ешерихия коли. 3 1.2 Нарушения на чревната флора и заболявания. 4 1.3 Пробиотици. 6 1.3.1 Определение, изисквания, примери. 6 1.3.2 Ефекти и механизми. 7 1.3.3 Области на приложение. 9 1.3.4 Mutaflor и Escherichia coli Nissle 1917. 10 1.3.5 Пробиотици от SymbioPharm. 10 1.3.5.1 Продуктите от SymbioPharm. 10 1.3.5.2 Симбиофлор 2 - състав и активни начала. 11 1.4 Геномно секвениране на Е. coli. 12 1.5 Антимикробни пептиди от прокариоти. 13 1.5.1 Определение и класификация на бактериоцините. 13 1.5.2 Микрозин. 15 1.5.3 Области на приложение - настояще и бъдеще. 18 1.6 Задача и цел. 20 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ. 21 2.1 Материали. 21 2.1.1 Използвани химикали и консумативи. 21 2.1.2 Използвани комплекти. 21 2.1.3 Буфери и разтвори за запаси. 21 2.1.4 Културни среди за отглеждане на бактерии. 22 2.1.5 Антибиотици. 2.1.6 Аксесоари за клетъчна култура. 23 А

Съдържание 2.1.7 Бактериални щамове. 24 2.1.8 Плазмиди. 2.1.9 Олигонуклеотиди. 26 2.1.10 Ензими. 27 2.1.11 Софтуер. 27 2.2 Методи. 28 2.2.1 Култивиране на прокариотни клетки. 28 2.2.1.1 Култивиране на бактерии. 28 2.2.1.2 Животновъдство. 28 2.2.1.3 Криви на растежа. 28 2.2.2 Култивиране на еукариотни клетки. 29 2.2.2.1 Клетъчна култура. 29 2.2.2.2 Замразяване и размразяване. 29 2.2.3 Експерименти за съвместна култура с прокариотни и еукариотни клетки. 29 2.2.3.1 Анализ на придържане. 29 2.2.3.2 Анализ за инвазия. 31 2.2.3.3 Конфокална микроскопия. 32 2.2.3.4 Електронна микроскопия. 32 2.2.3.5 Тест на зоната на инхибиране. 33 2.2.4 Молекулярно-биологични методи. 33 2.2.4.1 Полимеразна верижна реакция (PCR). 33 2.2.4.2 Последователност на къси ДНК секции. 35 2.2.4.3 Електрофореза в агарозен гел. 36 2.2.4.4 Пречистване на ДНК. 36 2.2.4.4.1 Пречистване на ДНК фрагменти. 36 2.2.4.4.2 Пречистване чрез гел екстракция. 37 2.2.4.4.3 Пречистване на секвениращи реакции. 37 2.2.4.4.4 Алкохолни валежи. 37 2.2.4.5 Определяне на концентрацията на ДНК. 38 2.2.4.5.1 Измерване на абсорбцията. 38 2.2.4.5.2 Определяне на концентрацията в агарозен гел. 38 2.2.4.6 Използване на рестрикционни ендонуклеази. 38 2.2.4.7 Дефосфорилиране. 39 2.2.4.8 Лигиране. 39 2.2.4.9 Производство на компетентни клетки. 39 2.2.4.10 Електропорация. 40 2.2.4.11 Конюгация. 40 Б

Съдържание 3.2.3.3 Escherichia coli G3/10 - Откриване на антимикробен пептид. 86 3.2.4 Откриване на Mikrozin S в Escherichia coli G3/10. 89 3.2.4.1 Анализ на кодирането на оперон за Mikrozin S. 89 3.2.4.2 Имунитет срещу микрозин стр. 90 3.2.4.3 Скрининг за наличие на гена mcss, кодиращ микрозин S в Enterobacteriaceae. 92 3.2.4.4 Доказателство за бактерициден ефект на микрозин стр. 92 3.2.4.5 Тест на зоната на инхибиране. 94 3.2.4.6 Експерименти за коинфекция с ентерохеморагична Е. coli. 95 3.2.4.7 Анализ на белтъчната структура и класификация. 99 4 ДИСКУСИЯ. 103 4.1 Symbioflor 2 E. coli - анализ на генома и пробиотици. 103 4.1.1 Геномите на Symbioflor 2 E. coli. 104 4.1.2 Пробиотичен ефект на Symbioflor 2. 105 4.1.3 Безопасност на Symbioflor 2. 106 4.1.4 Сравнение на Escherichia coli G3/10 с Escherichia coli Nissle 1917. 109 4.2 Антимикробни пептиди в Enterobacteriaceae. 111 4.3 Възможни употреби на микрозин стр. 113 4.3.1 Хранителната промишленост. 113 4.3.2 Микрозин S - нов антибиотик. 115 4.3.3 EHEC - пример за приложение. 116 5 РЕЗЮМЕ/РЕЗЮМЕ. 119 5.1 Резюме. 119 5.2 Резюме. 120 6 ЛИТЕРАТУРА. 123 7 ПРИЛОЖЕНИЕ. 140 ПУБЛИКАЦИИ. 172 ПРИЗНАВАНИЯ. 174 г.

Списък на съкращенията SAP SD SDS Singleton-Gen Sm sp. ssp. ST STEC stx SUE T a TBE TE Tet TNF trna U UE UPEC UV V VTEC ZKBS ZO Скариди алкална фосфатаза стандартно отклонение натриев додецил сулфат ген, който е специфичен за геном Стрептомицин вид Подвид Топлоустойчив токсин Шига токсин произвеждащ E. coli Шига токсин Сериозни нежелани Събития Температура на натрупване Трис-борат-ЕДТА Трис-ЕДТА Тетрациклин Тумор Некроза Фактор Трансфер Фактори Рибонуклеинова киселина Нежелани събития Уропатогенен Е. coli Ултравиолетов волт Производство на веротоксин E. coli Централна комисия по биобезопасност Zonula occludens G

Списък на фигури Фигура 3.31: Скрининг за микрозиновия H47 ген mchb в различни EHEC щамове. 99 Фигура 3.32: Аминокиселинна последователност на предшественика протеин Mikrozin S. 99 Фигура 3.33: Сравнение на аминокиселинните последователности на прекурсорните протеини от микрозини от клас IIa. 101 Фигура 4.1: Сравнение на последователността в промоторната област на hlycabd оперона на E. coli G1/2 и E. coli CFT073. 108 Фигура 4.2: Структурни компоненти на EcN (A) и E. coli G3/10 (B). 110 Фигура 7.1: BLASTp анализ на протеините McsA (A) и McsB (B). 164 I.

Въведение 1.5.2 Микрозин Терминът микрозин е въведен през 1976 г. (Asensio и Perez-Diaz, 1976) за означаване на рибозомно синтезирани антимикробни пептиди с ниска молекулна маса 5 kda. Пептидният скелет не е подложен на никаква модификация. Линейните полипептиди имат С-краен сидерофор като пост-транслационна модификация (Vassiliadis et al., 2007). Микрозините от клас IIa обикновено са организирани в четири гена, кодирани върху големи плазмиди с малък брой копия. Те включват микрозините V (MccV, бивш ColV), L (MccL) и 24 (Mcc24). В непосредствена близост до микроцина се кодира имунитетен протеин. Освен това се образуват два протеина, участващи в износа. Транспортните протеини в клас микроцинк са силно хомоложни. Самите микрозини имат характерни сигнални пептиди. MccV и MccL образуват дисулфидни мостове. За разлика от всички споменати досега микрозини, микрозините от клас IIb са хромозомно кодирани. Генетичната организация е много сложна. Пробиотичният щам E. coli Nissle 1917, който образува микрозините M (MccM) и H47 (MccH47) (Patzer et al., 2003), служи за пример. Кодиращият регион на микрозина съдържа гени 17

Материали и методи psym5 psym6 psym7 psym8 psym9 psym10 psym11 psym12 psym1-st76an Amp R, pilx-конюгационна система, mcss, mcsi, mcsa, mcsb тази работа тази работа тази работа тази работа тази работа тази работа тази работа тази работа тази работа paz6 Amp R, mcss, mcsi, mcsa, mcsb тази работа paz8 amp R, mcsi, mcsa, mcsb тази работа paz9 cm R, mcss тази работа paz10 cm R, ORF1 тази работа paz11 cm R, ORF2 тази работа paz12 cm R, съкратена mcss тази работа paz13 Amp R, mcsi this work paz14 Amp R, съкратено mcsi this work paz15 Amp R, PBAD, mcss this work pgs1 Amp R, PBAD this work MCS = Множество места за клониране; ori TS = температурно чувствителен произход на репликацията; I-SceI = мегануклеаза; FRT = Цел за разпознаване на флипаза; FLP = флипаза; ORF = отворена рамка за четене; PBAD = промотор на активатор на arac; Amp = ампицилин; Cm = хлорамфеникол; Кана = канамицин; Tet = тетрациклин. 2.1.9 Олигонуклеотиди Списък на олигонуклеотидите, използвани от Biomers (Ulm), е даден в допълнението в таблица 7.1 и таблица 7.2. 26-ти

Резултати 3 РЕЗУЛТАТИ 3.1 Анализ на бактериалните геноми 3.1.1 Геномът на Escherichia coli G3/10 Последователността се извършва, както е описано в раздел 2.2.5.1. Геномът на E. coli G3/10 се състои от 4 935 403 основи. Съдържанието на GC е 50,88%. Автоматичното и ръчно анотиране идентифицира 4844 гена, 87 trna преписи и 22 rrna преписи. Геномът в кръгла форма е показан на фигура 3.1. По време на анотацията на всяка кодираща последователност (CDS) беше присвоено име, така наречения локусен маркер, име на ген и генен продукт с кратко описание. BLASTn и BLASTp анализи и сравнения със записи в съответните бази данни (Altschul et al., 1990) (източници: [5,6]) послужиха като основа за това. Кадрите за четене бяха анотирани автоматично и при необходимост коригирани ръчно (вж. 2.2.5.3). Началото на генома на E. coli G3/10 се определя от гена dnaa. Понастоящем геномът се състои от четири големи участъка с три празнини с неопределена последователност, които не могат да бъдат затворени чрез PCR. Пълната геномна последователност ще бъде свободно достъпна в база данни след публикуване (Zschüttig et al., Ръкопис в подготовка). 51

Резултати Фигура 3.1: Кръгово представяне на генома на E. coli G3/10. Външният пръстен съдържа скалата в килобази (kbp). Във втория пръстен гените на предната верига са показани в синьо. Пръстен 3 показва гените на ядрения геном, който той съдържа, в черно. Пръстен 4 и пръстен 5 съответно показват гените на комплементарната верига в синьо с гените на ядрения геном в черно. Двата вътрешни пръстена показват GC съдържанието (пръстен 6) и GC изкривяването (пръстен 7), с помощта на които може да се определи произходът на репликацията oric и терминал terc. Предната и комплементарната верига съдържат приблизително еднакъв брой гени (пръстен 2 и 5). Гените на ядрения геном (пръстени 3 и 4) са разпределени по двете вериги. Някои по-големи области, които не съдържат никакви гени на основния геном, съответстват на геномни острови и профагични региони, в които съдържанието на GC се различава значително от средното съдържание на GC в генома в някои случаи (пръстен 6). Те често се свързват с trnas. CDS = кодиращи последователности. 52

Резултати E Фигура 3.2AE: Кръгово представяне на геномите на E. coli G1/2 (A), E. coli G4/9 (B), E. coli G5 (C), E. coli G6/7 (D) и E. coli G8 (E). Външният пръстен съдържа скалата в килобази (kbp). Във втория пръстен гените на предната верига са показани в синьо. Пръстен 3 показва гените на ядрения геном, който той съдържа, в черно. Пръстен 4 и пръстен 5 съответно показват гените на комплементарната верига в синьо с гените на ядрения геном в черно. Двата вътрешни пръстена показват GC съдържанието (пръстен 6) и GC изкривяването (пръстен 7), с помощта на които може да се определи произходът на репликацията oric и терминал terc. Предната и комплементарната верига съдържат приблизително еднакъв брой гени (пръстен 2 и 5). Гените на ядрения геном (пръстени 3 и 4) са разпределени по двете вериги. Някои по-големи области, които не съдържат никакви гени на основния геном, съответстват на геномни острови и профагични региони, в които съдържанието на GC се различава значително от средното съдържание на GC в генома в някои случаи (пръстен 6). Те често се свързват с trnas. CDS = кодиращи последователности. 56

Резултати Геномотипи на Е. coli, локализирани от Symbioflor 2. EcN се счита за особено приспособим поради над средния си брой системи за абсорбция на желязо (Grozdanov et al., 2004). Геномотипите на E. coli от Symbioflor 2 носят някои системи за усвояване на желязо и те създават конкурентни предимства. В тези E. coli обаче няма повече системи за усвояване на желязо, отколкото в други сравними щамове на E. coli. 3.1.4 Плазмидите Symbioflor 2 E. coli са диви видове, които носят няколко естествени плазмида. Фигура 3.6 показва общ преглед на всички плазмиди, съдържащи се с помощта на изображение на агарозен гел. 62 Фигура 3.6: Плазмиди в диви видове Symbioflor 2 E. coli. Номерирането съответства на името на плазмида, напр. 3 за плазмида psym3. * psym1 работи на нивото на геномната ДНК. psym5 и psym6 са трудно видими в изображението на гела и вероятно се намират в много малък брой копия. М = стандартен размер.

Резултати Структурата на пръстена беше затворена ръчно. Те вероятно ще бъдат в много малък брой копия. Фигура 3.7: Megaplasmid psym1 от E. coli G3/10. С дължина над 40 kb, плазмидът е 99% идентичен с pmas2027 от уропатогенната Е. coli MS2027 (Ong et al., 2009). В допълнение обаче се вмъква 10 kb област (маркирана в синьо), в която се кодира новоидентифицираният микрозин S в тази работа (вж. 3.2.4). Двата външни пръстена съдържат кодиращите последователности (CDS) на предната и обратната верига. Съдържанието на GC е показано в черно в третия ринг. Пръстен 4 показва GC-Skew в зелено (+) и лилаво (-). 64

Резултати ori endo 4000 1800 200 rom/rop 3000 psym2 4197 bps 1000 1400 1600 psym3 1934 bps 400 600 1200 800 2000 1000 csm repa 1200 6000 200 1000 1000 psym4 1304 bps 400 repa 5000 psym5 6567 bps 2000 800 4000 600 3000 ori mobc 10000 4000 8000 psym6 10433 bps 2000 psym7 4452 bps 1000 3000 6000 4000 2000 moba tnpa mobb tnpr mobd Фигура 3.8: Плазмидни карти на плазмидите, съдържащи се в Symbioflor 2 E. coli с анотация на кодиращите последователности. 65

Резултати ORF-3 12000 2000 2000 ORF-1 ORF-1 1500 psym8 2353 bps 500 ORF-2 ORF-4 ORF-5 10000 8000 psym9 12686 bps 4000 1000 6000 ORF-8 ORF-2 ORF-7 ORF-6 1400 ori 3000 repa 200 500 1200 psym10 1549 bps 400 2500 psym11 3215 bps 1000 1000 600 2000 800 1500 orit ori mobd/mbkd mobb/mbkb 7000 6000 1000 moba/mbka 5000 psym12 7111 bps 2000 csa mobc/mbkc 4000 3000 oriv csl csi Фигура 3.8: Плазмидни карти на плазмидите, съдържащи се в Symbioflor 2 E. coli с анотация на кодиращите последователности. (Продължение). 66

Фигура 3.9: Контрол на специфичността на разработените специфични за щам и група PCR за E. coli G1/2, G6/7 и G8 (A), E. coli G3/10 (B), E. coli G4/9 (C) и Е. coli G5 (D). Получените ленти са рамкирани в червено. Цифрите (#) се отнасят до главната колекция на работната група Gunzer. М = стандарт за размер, NK = отрицателен контрол.

Таблица с резултати 3.5 Преглед на геномите на Symbioflor 2 E. coli (към януари 2012 г.). Генотип E. coli G1/2 E. coli G3/10 E. coli G4/9 E. coli G5 E. coli G6/7 E. coli G8 Брой плазмиди Приблизителна дължина на хромозомата [bp] 1 Приблизителна дължина на генома [bp] 1.2 Контиг номер 1 Прогнозен брой гени 2 Брой trna 2 4,748,500 4,757,160 36 4,478 82 22 6 4,935,403 5,010,410 4 4,844 87 22 1 4,514,694 4,515,998 29 4,663 72 22 5 4,578,897 4,603,537 43 4,296 84 22 2 4 978 623 4 987 283 41 4 729 81 22 2 4 873 886 4 882 546 62 4636 73 22 номер rrna 1 Стойностите съответстват на контигите, присвоени към датата. 2 Геномът се състои от хромозомата плюс плазмидите. E. coli G4/9 E. coli G5 E. coli G3/10 E. coli G6/7 E. coli G8 E. coli G1/2 Фигура 3.10: Сравнение на генома на Symbioflor 2 E. coli (към януари 2012 г.). Филогенетичното дърво е генерирано с помощта на EDGAR (Blom et al., 2009) и на базата на основните геноми. 70

Резултати Фигура 3.31: Скрининг за микрозиновия H47 ген mchb в различни EHEC щамове. Различни EHEC щамове, EcN и Е. coli G3/10 бяха тествани с използване на праймерите mchb_bamhi и mchb_sphi. Генът на микрозина H47 е открит в щамовете EHEC DD, FO1 и FO2. ПК = положителен контрол, NK = отрицателен контрол. 3.2.4.7 Анализ на структурата на белтъците и класификация Микрозинът S (MccS), идентифициран в E. coli G3/10, е протеин от 120 AA с изчислено молекулно тегло 11,67 kda. Терминът микрозин е въведен за малки антибактериални пептиди с молекулно тегло