Влияние на индуцируема хем оксигеназа (HO-1) върху микроциркулацията при пост-исхемичен панкреатит

От клиниката по хирургическа университетска клиника по обща и висцерална хирургия към Университета Алберт Лудвиг във Фрайбург i.br. Влияние на индуцируема хемоксигеназа (HO-1) върху микроциркулацията при пост-исхемичен панкреатит I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N за получаване на докторска степен от Медицинския факултет на Алберт-Лудвигс-Университет Фрайбург i.br. Представено през 2006 г. от Мориц Шолтес, роден в Аахен

ho-1

2 декан: проф. Д-р мед. C. Peters 1-ви рецензент: PD Dr. мед. О. Томуш 2-ри рецензент: проф. Д-р мед. Б. Разбивки Година на дипломиране: 2007

4 Тази работа се ръководи от д-р. мед. Е. фон Добшюц

5 СЪДЪРЖАНИЕ 1. ВЪВЕДЕНИЕ. 7 1.1 ОСТРИ ПАНКРЕАТИТ. 7 1.2 МИКРОЦИРКУЛАЦИЯ. 8 1.3 ИШЕМИЯ РЕФЕРФУЗИЯ. 9 1.4 ХЕМДЕГРАДАЦИЯ ПО ХЕМОКСИГЕНАЗА. 11 1.4.1 Реакцията на хем оксигеназа и нейните продукти. 12 1.4.1.1 Желязо. 13 1.4.1.2 CO. 13 1.4.1.3 Биливердин и билирубин. 13 1.4.2 HO изоензими: структура, разпределение, регулиране. 14 2. ЦЕЛ НА ИЗСЛЕДВАНЕТО. 17 3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ. 18 3.1 ПРЕДВАРИТЕЛНА ЗАБЕЛЕЖКА. 18 3.2 ЕКСПЕРИМЕНТАЛЕН МОДЕЛ. 18 3.2.1 Експериментални животни. 18 3.2.2 Предварително лечение и лекарства. 18 3.2.3 Анестезия и вентилация. 19 3.2.4 Микрохирургична технология. 20 3.3 МЕТОДИ ЗА ИЗПИТВАНЕ. 23 3.3.1 Макрохемодинамика. 23 3.3.2 Микрохемодинамика. 23 3.3.2.1 Функционална капилярна плътност. 24 3.3.2.2 Взаимодействие между бели кръвни клетки и ендотел. 3.3.3 Лабораторни параметри. 26 3.3.4 Определяне на HO-1. 26 3.3.4.1 Доказателство за дейност. 27 3.3.4.2 Анализ на Northern blot. 29 3.3.4.3 Анализ на Western blot. 31 3.4 ЕКСПЕРИМЕНТАЛЕН ПРОТОКОЛ. 32 3.4.1 Тестови групи. 32 3.4.2 Процедура за изпитване. 32 3.4.2.1 Условия за контрол. 32 3.4.2.2 Исхемично-реперфузионен панкреатит. 33 3.4.2.3 Индукция на хем оксигеназа 1. 34 3.4.2.4 Инхибиране на активността на хем оксигеназа. 35 3.5 СТАТИСТИКА. 35

6 4. РЕЗУЛТАТИ. 36 4.1 МАКРОХЕМОДИНАМИКА. 36 4.2 МИКРОХЕМОДИНАМИКА. 38 4.2.1 Функционална капилярна плътност. 38 4.2.2 Левкоцитно-ендотелно взаимодействие. 41 4.3 ЛАБОРАТОРНИ ПАРАМЕТРИ. 44 4.4 ОТКРИВАНЕ НА ХЕМОКСИГЕНАЗА. 45 4.4.1 Доказателство за дейност. 45 4.4.2 Северно петно. 46 4.4.3 Western blot. 47 4.5 ПРЕГЛЕД. 47 5. ДИСКУСИЯ. 48 5.1 ОБСЪЖДАНЕ НА МЕТОДОЛОГИЯТА. 48 5.1.1 Експериментален остър панкреатит. 48 5.1.2 Измерени параметри. 51 5.1.2.1 Количествено определяне на микрохемодинамиката. 51 5.1.2.2 Количествено определяне на левкоцитно-ендотелното взаимодействие. 53 5.1.2.3 Доказателство за дейност. 55 5.1.2.4 Северно петно. 56 5.1.2.5 Western blot. 57 5.2 ОБСУЖДАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ. 58 5.2.1 Влияние на исхемия и реперфузия. 58 5.2.1.1 Макро хемодинамика. 58 5.2.1.2 Микрохемодинамика. 58 5.2.1.3 Левкоцитно-ендотелно взаимодействие. 62 5.2.1.4 Експресия и активност на хем оксигеназа. 63 5.2.2 Влияние на HO-1. 65 5.2.2.1 Макро хемодинамика. 66 5.2.2.2 Микрохемодинамика. 66 5.2.2.3 Левкоцитно-ендотелно взаимодействие. 69 5.2.2.4 Експресия и активност на хем оксигеназа. 71 6. РЕЗЮМЕ. 72 7. СПИСЪК НА ЛИТЕРАТУРАТА. 73 8. СПИСЪК НА ФИГУРИТЕ И ТАБЛИЦИТЕ. 92 9. СПИСЪК НА СЪКРАЩЕНИЯТА. 95 10. ПРИЗНАВАНИЯ. 96 11. ЖИВОТИ. 98

10 Тези механизми водят до нарушение на микроциркулацията, което от своя страна води до намалено енергоснабдяване на тъканта и по този начин поддържа порочния кръг (Фигура 1). Na + -K + - АТФаза Na + -Ca 2+ - Антипорт ATP Na + Ca 2+ Протеази XDh O 2 Hyx + XOx Исхемия Кръв-O 2 Реперфузия O 2 -радикална пропускливост Едем Тромбоза Съсирване на левкоцити Деградация на ECM Увреждане на мембраната Микроциркулационно разстройство Активиране на левкоцитите Увреждане на клетките Ендотелни увреждания Ензими Цитокини Фигура 1: Порочен кръг на исхемично-реперфузионно увреждане: Процесите при исхемия (горе) причиняват увреждане на клетките при реперфузия (отдолу), което води до допълнително хипоксично увреждане на тъканта

17 2. ЦЕЛ НА ИЗСЛЕДВАНЕТО Целта на настоящото експериментално проучване е да изследва ефектите от едночасова исхемия и двучасова реперфузия върху микроциркулацията на панкреаса. Беше изследвано дали и как условията се променят с течение на времето. Освен това трябва да се определи дали и по какъв начин екзогенната индукция на индуцируема хем оксигеназа (HO-1) влияе върху тези състояния. По-специално бяха изследвани функционалната капилярна плътност като параметър на хранителната ситуация при реперфузия и левкоцитно-ендотелното взаимодействие като параметър за ранната възпалителна реакция. За определяне на тези параметри е използван методът на интравитална епифлуоресцентна микроскопия. Влиянието на хем оксигеназата в нейната експресия и активност е проверено чрез молекулярна биология. Работата е разделена на следните раздели: 1. Ефекти от исхемия и реперфузия върху микроциркулацията на панкреаса без екзогенно влияние върху хем оксигеназата 2. Ефекти от индукцията на хем оксигеназа върху микроциркулацията на панкреаса при пост-исхемичен панкреатит

22 Фигура 5: Схематичен ход на съдовете в артериите на панкреаса (от HOFFMANN 70)