Синдром на майката с фенилкетонурия при мишки предполага възможен подход за такъв

  • субекти
  • абстрактно
  • заден план
  • Методи
  • Резултати
  • Заключение
  • Основна
  • Методи
  • Ретроспективен клиничен преглед на записите
  • Животни, грижи и процедури
  • ПЕГилирана рекомбинантна Phe амонячна лиаза
  • Анализ на Phe
  • Анализ на аминокиселини
  • Фармакодинамично моделиране
  • Резултати
  • PKU по майчина линия: Опитът на Медицинския колеж на Университета във Флорида
  • Pegvaliase и PKU мишката
  • дискусия
  • Още информация
  • Word документи
  • Още информация
  • Допълнителни методи
  • Допълнителна фигура S1
  • Допълнителна фигура S2
  • Допълнителна таблица S1
  • Excel файлове
  • Допълнителни таблици

субекти

  • Биологична терапия
  • Ендокринна система и метаболитни заболявания
  • Педиатрични изследвания
  • Курс на бременност

абстрактно

заден план

Нелекуваната фенилкетонурия (PKU), едно от най-често срещаните генетични заболявания при хората, обикновено води до интелектуални затруднения. Въпреки че изкуствените диети, ограничени до протеини, могат да предотвратят забавянето, спазването на диетите често е лошо при възрастни. При бременни PKU жени неспазването може да доведе до синдром на PKU при майката, при който високите нива на фенилаланин (Phe) причиняват тежки фетални усложнения. Ензимната заместителна терапия с Phe амонячна лиаза (PAL) коригира PKU в мутантни BTBR Phe хидроксилазни мишки (Pah enu2), което предполага възможно лечение на синдрома на PKU при майката при хора.

Методи

Прегледахме клиничните данни, за да оценим честотата на синдрома на майката ПКК при бременни жени ПКК. Ние лекувахме женски PKU мишки (на нормална диета) с PAL, стабилизирахме Phe на физиологични нива и ги чифтосахме, за да оценим резултатите от бременността.

Резултати

Медицинските досиета показват, че ефективността на диетата за предотвратяване на синдрома на майката PKU за съжаление не се е подобрила значително, откакто проблемът се появи за първи път преди 40 години. Лечението с PAL на бременни PKU мишки показва, че потомството на лекувани с PAL майки оцелява до зряла възраст, за разлика от общата леталност, наблюдавана при нелекувани мишки, или намалена степен на преживяемост при мишки на PKU диета.

Заключение

Лечението с PAL намалява тежестта на синдрома на майката PKU при мишки и може да има потенциал да повлияе терапията на човешки PKU.

Развиващият се плод при майки с лошо контролиран ФКУ може да бъде неблагоприятно повлиян от вътрематочна експозиция на повишени нива на Phe. Съвместното проучване на фенилкетонурия при майките установи, че повишените нива на Phe в майчината кръв са тератогенни (5, 6, 7, 8, 9). Децата със синдром на майката PKU страдат от микроцефалия, краниофациален дисморфизъм, ниско тегло при раждане, вродени сърдечни заболявания, забавяне на развитието и интелектуални затруднения (10, 11, 12). През 1980 г. 95% от майките с 524 бременности при 155 жени с концентрация на Phe в кръвта ≥ 1200 μM са имали поне едно умствено увредено дете (13). Честотата на интелектуални затруднения, микроцефалия и вродени сърдечни заболявания са много по-чести, отколкото сред общата популация и корелират с концентрациите на Phe в кръвта на майката.

PKU мишката е утвърден модел за човешки PKU и има клинични характеристики, подобни на тези при пациенти с PKU, включително хиперфенилаланемия (изходни плазмени концентрации на Phe от 1000 до 2000 μM), хипопигментация, когнитивни дефекти, аудиогенни гърчове и синдром на PKU при майката (21, 22). . В предишни проучвания еднократно седмично подкожно приложение на пегвалиаза в дози от 80 mg/kg на мъжки PKU мишки понижава плазмените нива на Phe с ≤ 1200 μM при мишки носители на enu2 (HET) и хомозиготен BTBR за период до 10 месеца Мутантните мишки на Pahenu2 (PKU) (21) първоначално са от Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Всички протоколи са одобрени от Университета на Флорида IACUC. Мишките бяха задържани за лечение с пегвалиаза и пегвалиазата беше инжектирана подкожно в горната част на гърба и долната част на шията. Плазмен Phe е получен от 45. l кръвна проба, събрана в хепаринизирана микрокапилярна тръба.

ПЕГилирана рекомбинантна Phe амонячна лиаза

PEGylated, рекомбинантна форма на Anabaena variabilis pegvaliase е предоставена от BioMarin Pharmaceutical (Novato, Калифорния). Стерилен разтвор от 10 mg/ml (

12 IU/ml) пегвалиазата се разрежда до 5 mg/ml седмично и се съхранява при 0 ° С. Аликвотни части се разреждат до 0,5–2,0 mg/ml в зависимост от желаната доза и се инжектират 10 μl/g телесно тегло.

Анализ на Phe

Плазменият Phe се определя с помощта на флуорометричен анализ (24), който е широко модифициран за малки обеми, бързи времена на обръщане и формат на микротитърната плоча. Плазмата от кръвни проби беше замразена до анализа. Аликвотна част (7,5 µl) от всяка плазмена проба се освобождава от протеини, поставя се в 96-ямкова PCR плака с пробен коктейл и се инкубира в продължение на 2 часа при 60 ° С. Меден реагент се добавя към всяка ямка на 0,5 ml 96-ямкова черна флуориметрова плака (Nunc, Roskilde, Дания, критична за точното определяне на плазмения Phe) и се добавят инкубираните плазмени проби. Плочата беше върху четец за плочи SpectraMax M2 (Molecular Devices, Сънивейл, Калифорния) с параметри на възбуждане: 378 nm; Емисия: 512 nm.

Анализ на аминокиселини

Единични аминокиселини и стандарти (Sigma) и високоефективни реактиви за течна хроматография (Fisher) са получени от Sigma Chemical (St. Louis, MO) и Fisher Scientific (Atlanta, GA). Плазмените проби се депротеинизират и се добавя норлевцин като вътрешен стандарт. Изсушените проби се дериватизират с фенилтиокарбамил, изсушават се под вакуум, излишъкът от реагент се отстранява и се хроматографира върху Becman System Gold LC с UV-VIS детектор (254 nm) и аналитична колона с обратна фаза Phenomenex C18. Концентрациите на аминокиселини са изчислени, като се използват стандартни/вътрешни стандартни пикови области в сравнение с пробните пикови области.

Фармакодинамично моделиране

Фармакокинетичните параметри са определени от еднодозови фармакокинетични/фармакодинамични проучвания (Musson и Laipis, данните не са показани) при наивни мишки. Плазмените проби се анализират за нива на пегвалиаза от BioMarin Pharmaceutical, като се използва специфичен за пегвалиаза сандвич ензимно свързан имунологичен анализ. Свързаната пегвалиаза се открива с анти-PEG антитяло. Границата на количественото определяне е 60 ng/ml. Плазмените нива на Phe се определят, както е описано по-горе. Плазмените концентрации на Phe в плазмата при различни режими на дозиране на пегвалиаза са моделирани с помощта на софтуер WinNonlin версия 5.2 (Certara, Princeton, NJ, USA).

Резултати

PKU по майчина линия: Опитът на Медицинския колеж на Университета във Флорида

Медицинският колеж на Университета на Флорида, Катедра по педиатрия, Катедра по клинична генетика и метаболизъм, обслужва региона на Северна Флорида от Пенсакола до Джаксънвил до Орландо. Това е университетски медицински център, който лекува повечето пациенти с PKU в района поради тяхното разстройство. Бременните PKU жени получават пренатални консултации и интензивна хранителна терапия поради рисковете за плода. Въпреки че разстоянието до центъра прави редовните посещения неудобни за много пациенти, те непрекъснато биват съветвани относно диетата и са помолени да представят седмични стойности на Phe в кръвта и телесно тегло. Нашите препоръки за бременни (и вероятно бременни) PKU жени са да поддържат нивата на Phe в кръвта между 120 и 240 μM и Tyr над 50 μM, да се придържат към препоръчителния прием на хранителни вещества за бременност и да насърчават подходящото наддаване на тегло.

Ние ретроспективно разгледахме записи на 28 бременности между 1996 и 2010 г. Пациентите бяха разделени в три групи:

Група 1: Отличен контрол на Phe (3/28) - Средните стойности на Phe в кръвта по време на бременност са били под 360 μM, с максимални стойности под 420 μM Phe във всеки момент от времето и най-малко шест стойности на Phe, записани през първия триместър.

Група 2: Граничен контрол на Phe (11/28) - Средните нива на Phe в кръвта са били под 420 µ през първия триместър М и след това през втория и третия триместър средно под 360 µ. М. Пациенти с начална плазмена стойност на Phe от 700 μM или по-малко през първия триместър и две или по-малко стойности над 500 μM през останалата част от бременността.

Група 3: Неадекватен контрол на Phe (14/28) - средните плазмени нива на Phe са над 420 μM през първия триместър, със средни стойности над 360 μM през останалата част от бременността и/или с множество стойности над 420 μM.

Средните стойности на Phe през 40-те седмици на бременността за трите пациентски кохорти са показани на допълнителна онлайн фигура S1. Резултатът от всяка бременност, класифициран като нормален или засегнат, въз основа на параметрите на раждане (тегло, височина, обиколка на главата), наличните данни от клиничен преглед и наличието на състояния, свързани със синдрома на PKU при майката, е обобщен в допълнителна таблица S1. Има ясни разлики между групите (абсолютна стойност на Phe, постигнато ниво на контрол, максимални стойности на Phe, записани през всеки интервал от време и резултати от бременността); Подробно описание на всяка група може да се намери във файла „Допълнителен клиничен резултат“.

Pegvaliase и PKU мишката

За да се оцени потенциалната терапевтична полза от пегвалиазата при лечението на бременни жени с ПКК и техните фетуси в риск от ПКК при майката, ние изследвахме неговите ефекти върху синдрома на майката ПКК при женски мишки ПКК, използвайки различни дози и схеми на лечение. Резултатите от нашите изследвания са обобщени в таблица 1; Подробни резултати за всяко проучване са показани в допълнителна таблица S2. Тук отбелязваме, че PKU синдромът на майката е значително по-тежък при PKU мишка, отколкото при пациенти с PKU при хора. Пълната смърт на новороденото през първите 24 часа от живота е обичайният резултат (21). Освен това, въпреки че диетата с ограничен Phe може частично да коригира синдрома на PKU при майките при PKU мишки, малко кученца оцеляват при отбиване на диета с нисък Phe.

50 g, а приемът на храна ще е повече от два пъти. Приемът на храна се нормализира след раждането, но отново се увеличава по време на кърмене, тъй като кърмещата майка храни 40 до 50 грама кученца 14 дни след раждането, когато кученцата започнат да опитат твърда храна. Тези фактори показват, че схемите на дозиране два пъти седмично, използвани при възрастни небременни мишки, не успяват да поддържат адекватно стабилни физиологични плазмени нива на Phe по време на бременност.

Първоначално подозирахме, че плазмените нива на Phe при майката в проучване 08-005 може да са достигнали екстремни стойности, които са едновременно твърде ниски и твърде високи за оцеляването на кученцата, като проучването с ограничена диета Phe и краткото проучване на пегвалиазата. Полуживот (21, 23). Съответно, осем женски PKU мишки (Проучване 08-027) са били третирани последователно с протоколи за пегвалиаза, разработени чрез фармакодинамично моделиране, за да се получат средни плазмени нива на Phe от 250 ug. М при 4 µ М (таблица 1 и допълнителна таблица S2). Въпреки че окончателният протокол (понеделник, сряда, 10 mg/kg; петък, 20 mg/kg) е довел до отлично физическо състояние и увеличена продължителност на живота, размерът на постелята и броят на живите малки се увеличават само леко (среден размер на постелята 6 (2 носилка) от 10) кученца при раждане); 32% от бременните отбити кученца) са били наблюдавани. Тези жени са били значително по-възрастни по време на чифтосването поради корекции на протокола, необходими за постигане на желаното ниво на Phe в плазмата от 4 PM (Таблица 1).

В трето проучване (09-068a) 12 женски PKU мишки са лекувани с леко модифициран режим на дозиране (10 mg/kg пегвалиаза, понеделник, 8 ч. Сутринта; сряда, петък, 16 ч.), При което фармакодинамичното моделиране също води до еднородна плазма Phe трябва да осигури контрол (Фигура 1 и Таблица 1). Освен това плазмените проби бяха взети в 8 сутринта вместо в 16 часа. Тези 12 PKU мишки са имали средно 300 µg. Ниво на M Phe при 4 µ М, което показва добър контрол на нивата на Phe през седмицата, както се предвижда от фармакодинамичното моделиране. Въпреки това, стойностите в 8-AM кръвни проби бяха драстично увеличени (Фигура 1). Тези жени са били чифтосвани по време на този протокол за дозиране и са имали общо 39 бременности (таблица 1, допълнителна таблица S2). Малко над 50% от тези бременности са отбити кученца, със среден размер на котилото около шест кученца (пет котила от осем или повече кученца), което е по-добре от предишните резултати.

майката

Ежедневна промяна в плазмените нива на фенилаланин (Phe) при мишки, лекувани с пегвалиаза с фенилкетонурия (PKU). Дванадесет женски PKU мишки (Проучване 09-068a) бяха инжектирани подкожно с 10 mg/kg пегвалиаза три пъти седмично (понеделник, 8:00 ч. Сряда, 16:00 ч .; петък, 16:00 ч .; ↓). Фармакодинамичното моделиране на този дозов план (▪▪▪▪) предсказва добро регулиране на плазмените нива на Phe. Взети са кръвни проби (40 µl) в 8:00 ч. И 16:00 ч. В различни дни от седмицата за период от 7 седмици и нивата на плазмафета са осреднени, за да се получи съставна седмична графика на нивото на плазмафа (O). Основните хеш марки за оста x представляват дните от седмицата (12:00 ч.), А вторичните хеш марки за 8:00 ч. И 16:00 ч. Съставените данни от нелекувани женски PKU мишки (2, •) бяха повторени седем пъти, за да покажат максимално съгласие със седмичните плазмени Phe данни от лечението с пегвалиаза. Пиковите плазмени Phe се наблюдават при лекуваните животни в моменти, които съответстват на максималните плазмени нива на Phe при нелекувани PKU мишки, въпреки че значително намаляване на стойностите на 8-AM плазмен Phe в дните след прилагане на пегвалиаза Дозата се наблюдава.

майката

Ежедневна промяна в плазмените нива на фенилаланин (Phe) при нелекувани женски мишки с фенилкетонурия (PKU). Промяната в нивата на Phe в плазмата, настъпила по време на 24-часовия цикъл на тъмна светлина, се определя от анализ на съставни данни. Взети са кръвни проби (40 μl) от шест възрастни женски PKU мишки в посочените времена, като пробите са взети за период от 9 седмици, за да се избегне стрес поради загуба на кръв. Във всеки момент от всяко животно бяха взети две проби. Резултатите от плазмения Phe бяха комбинирани и осреднени, за да се получи 24-часовият съставни данни. Графиката показва бързото нарастване с над 1000 μM в плазмения Phe, което се случи, когато мишките се събудиха в 18:00 и започнаха да се хранят, и по-бавния спад от началото на светлинния цикъл в 6 сутринта.

майката

Друг фактор може да повлияе на лечението на синдрома на майката PKU с пегвалиаза. При нелекувани човешки PKU съотношението на Tyr към Phe често се намалява, като наблюдаваните плазмени нива на Tyr се намаляват до 50% от стойностите, наблюдавани при нормални контроли (25). Измерихме нивата на Trp, Tyr и Phe в третирани с WT, PKU и пегвалиаза PKU мишки чрез високоефективна течна хроматография (Фигура 4). Както при пациенти с ПКК при хора, плазмените нива на Tyr при PKU мишки са намалени от нормалните нива без промяна в нивата на Trp. Намаляването на PKU в плазмените нива на Phe до физиологични или субфизиологични нива чрез пегвалиаза няма ефект върху плазмения Tyr. Опитите за увеличаване на нивата на Tyr в лекуваната с пегвалиаза PKU мишка чрез добавяне на Tyr към питейната вода са неуспешни поради слабата му разтворимост. Следователно, използването на изкуствена диета с добавен Tyr (където ниската разтворимост не ограничава потенциалното усвояване) е необходимо, за да се определи възможната роля на ниския Tyr в частичния отговор на синдрома на майката PKU при PKU мишка.

синдром

Ароматни нива на аминокиселини в плазмата от женски мишки от див тип (WT) и фенилкетонурия (PKU). Плазмени проби, получени от нетретирани WT и PKU мишки и третирани с пегвалиаза PKU мишки, бяха анализирани чрез високоефективно разделяне на течна хроматография (HPLC). Плазмените проби от нелекувани PKU мишки показват значително повишено плазмено ниво на фенилаланин и 40-50% по-ниско плазмено ниво на тирозин в сравнение с WT мишки. Плазмените нива на триптофан остават сходни между двата генотипа. Лечението с пегвалиаза понижава плазмения Phe до физиологични или под нормалните физиологични стойности в зависимост от режима на дозиране. Нивата на тирозин и триптофан при нелекувани и третирани с пегвалиаза PKU мишки са сходни.

дискусия